Analisi di laboratorio per le malattie autoimmuni sistemiche paolo.gravina@ptvonline.it

AUTOIMMUNITA’ Disordine del sistema immunitario che non riconosce più le proprie strutture cellulari e tissutali e produce anticorpi diretti contro di esse.  L’attivazione persistente delle vie effettrici del sistema immunitario innesca una reazione autoaggressiva che può essere di tipo umorale e/o cellulare in grado di alterare l’integrità e la funzione delle cellule e degli organi bersaglio.

MALATTIA AUTOIMMUNE Una malattia autoimmune deve soddisfare i seguenti criteri: -evidenza di una reazione immunitaria verso autoantigeni; -riproducibilità nell'animale da esperimento mediante inoculazione dell'antigene specifico (le lesioni sono analoghe a quelle presenti nella patologia umana); - trasferibilità nell'animale da esperimento mediante iniezione di siero contenente autoanticorpi o di cellule autoreattive.

CARATTERI COMUNI A TUTTE LE MALATTIE AUTOIMMUNI familiarità maggior frequenza nel sesso femminile insorgenza apparentemente spontanea presenza di ipergammaglobulinemia decorso cronico, caratterizzato da esacerbazioni e remissioni E' anche possibile che manifestazioni cliniche di una forma si associno a manifestazioni di un'altra malattia autoimmune (sindromi da sovrapposizione).

Malattie autoimmuni Malfunzionamento del sistema immunitario Stato infiammatorio cronico del tessuto colpito Le malattie autoimmuni sono divise in: Connettiviti, non organo specifiche Malattie organo specifiche Malattie di tipo misto Incidenza in crescita Miglioramento capacità diagnostiche Aumentata sensibilità al problema

MALATTIE AUTOIMMUNI Sistemiche (MAS): Organo-specifiche: Lupus Eritematoso Sistemico (LES) Scleroderma Dermatomiosite, Polimiosite Malattia Mista del Tessuto Connettivo (MCTD) Sindrome di Sjögren Granulomatosi di Wegener Sindrome Antifosfolipidi (APS) Tiroidite autoimmune Diabete mellito Epatite autoimmune

PRINCIPALI AUTOANTIGENI A) ANTIGENI PROPRI DELLA MEMBRANA CELLULARE - Recettori di superficie - Antigeni vari AI organo-specifica o sistemica B) ANTIGENI INTRACITOPLASMATICI LIBERATI IN CIRCOLO IN SEGUITO A CITOLISI - Nucleari, microsomici, mitocondriali, etc. AI prevalentemente sistemica C) ANTIGENI INTRACITOPLASMATICI ESPRESSI IN SUPERFICIE (Fenomeno comune a tutte le cellule endocrine) - C. Tiroidee, Insulari pancreatiche, surrenali AI prevalentemente organo-specifica

AUTO-ANTICORPI NON DIVERSI DAGLI ANTICORPI "NATURALI" O INDOTTI DA ANTIGENI ESOGENI, SE NON PER LA REATTIVITA' VERSO AUTOANTIGENI

DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE MAS INDICI IMMUNOLOGICI INDICI DI FLOGOSI INDICI DI LESIONE CITO-TISSUTALE

Indici di flogosi VES PCR Sideremia ed Emoglobina : ridotte proporzionalmente alla estensione della flogosi per iperattività del sistema reticoloendoteliale e per alterazione del metabolismo del ferro.

INDICI IMMUNOLOGICI AUTOANTICORPI CIRCOLANTI ATTIVAZIONE DEL SISTEMA IMMUNITARIO PREDISPOSIZIONE GENETICA

DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE MAS: AUTOANTICORPI CIRCOLANTI NON INDICA L’ANDAMENTO DELLA MALATTIA RICHIEDE ESPERIENZA (IN PARTICOLARE PER L’INTERPRETAZIONE DEI QUADRI DI FLUORESCENZA AL MICROSCOPIO ) PREZIOSA PER LA DIAGNOSI CLINICA DA CORRELARE SEMPRE AL QUADRO CLINICO

AUTOANTICORPI CIRCOLANTI ANA ANTI - ds - DNA ANTI - ENA ACLA LAC ANTI - ss - DNA ANTI - ISTONI ANCA FR CLASSICO CRIOGLOBULINEMIA MISTA IgM - IgG ANTI - EMAZIE ANTI – PIASTRINE ( ANTI - CITRULLINA ) ( ANTI - ALFA FODRINA ) ( ANTI - NUCLEOSOMI ) ( ALTRI )

CLASSIFICAZIONE DIDATTICA ANA Antigeni nucleari estraibili :Sm, U1RNP, Ro(SSA), La (SSB), Jo1 (istidil tRNA sintasi), SCL70 (topoisomerasi) Antigeni nucleari non estraibili :DNAss, DNAds o DNAn, istoni, centromero Antigeni citoplasmatici :Jo-1, mitocondri, ribosomi

AUTOANTICORPI CIRCOLANTI INDAGINI DI 1° LIVELLO ANA

Connettiviti Tra i vari autoanticorpi si sono considerati gli ANA - anticorpi antinucleo:la loro presenza è una caratteristica peculiare delle malattie autoimmuni non organo specifiche Hep-2 sono i substrati più sensibili pertanto più indicati nella ricerca degli ANA

INDAGINE DI 1° LIVELLO ANA Gli anticorpi antinucleo (ANA) sono anticorpi diretti contro macromolecole nucleari naturali native e/o denaturate comunemente presenti nel siero dei pazienti con malattie autoimmuni

ANA FREQUENZA DI ASSOCIAZIONE CON LE MALATTIE AUTIMMUNI SISTEMICHE LES > 90 % CM 100 % SS 80 % SSJ 60 % P - DM 30 % AR 30 %

ANA …PRESENTI ANCHE IN PERSONE SANE A TITOLO BASSO IN CIRCA IL 18 % DELLE PERSONE SANE DI ETA’ > 65 AA IN CIRCA IL 4 % DELLA POPOLAZIONE SANA GIOVANE , A TITOLI MEDIO - BASSI

ANA NON TEST DI SCREENING DA RICHIEDERE SOLO SU INDICAZIONE CLINICA ( SOSPETTO DI MAS E / O DI ALTRE MALATTIE AUTOIMMUNITARIE COME L’EPATITE AUTOIMMUNE, L’ARTRITE CRONICA GIOVANILE, ECC. )

ANTI - ENA - Ab ANTI - SSA ( 52 KD E 60 KD ) ( RIBONUCLEOPROTEINE ) ANTI - SSB ( RIBONUCLEOPROTEINE ) ANTI - SM ( SMALL NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEINS ) ANTI - U1RNP ( SMALL NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEINS ) ANTI - SCL70 ( TOPOISOMERASI I ) ANTI - JO1 ( ISTIDIL - tRNA - SINTETASI , IN REALTA’ A LOCALIZZAZIONE NON ENDONUCLEARE , MA CITOPLASMATICA)

METODI ANALITICI Immunofluorescenza indiretta (IFI) Immunoprecipitazione, Immunodiffusione Controimmunoelettroforesi Emagglutinazione RIA / IRMA Western Blot Dot Blot, ImmunoBlot ELISA

L’IMMUNOFLUORESCENZA (IFI) L’ immunofluorescenza indiretta (IFI) è il metodo di riferimento per il dosaggio degli anticorpi anti-nucleo (ANA): Per la sua alta % di sensibilità e specificità Perche’permette di identificare sia il grado di positività che il tipo di pattern fluoroscopico

Antiglobulina umana marcata METODO D’IFI Ag-substrato Ab nel siero Immunocomplesso Antiglobulina umana marcata NB. Osservazione a microscopio a fluorescenza a x 400

Immunofluorescenza Indiretta Si presta alla ricerca di auto-anticorpi per individuare la presenza di malattie autoimmuni. Vantaggi:  Sensibilità e specificità di reazione. Semplicità e rapidità d’esecuzione. Facile riproducibilità. Permette di ottimizzare l’iter diagnostico. Costo contenuto. Indaga sulla presenza di auto-anticorpi e evidenzia pattern non ancora descritti. Limiti:  Tecnica soggettiva. Solubilità di alcuni antigeni nucleari. Non consente l’identificazione delle specificità anticorpali. Necessita di un sistema ottico efficiente.

Interpretazione dei risultati In ogni vetrino è presente: un controllo positivo un controllo negativo Sono riportate due informazioni: l’intensità della fluorescenza la descrizione del pattern. La classificazione delle immagini è fatta in base alla fluorescenza osservata (CDC di Atlanta) ++++: fluorescenza verde brillante massima positività +++: fluorescenza verde mela alta positività ++: fluorescenza positiva chiaramente distinguibile +: fluorescenza specifica più bassa 0: negativo

Hep-2: pattern omogeneo Fluorescenza che interessa in maniera diffusa ed omogenea tutto il nucleo

Hep-2: pattern periferico Fluorescenza che interessa prevalentemente la periferia del nucleo

Piccoli punti fluorescenti uniformi sparsi nel nucleo Hep-2: punteggiato fine Piccoli punti fluorescenti uniformi sparsi nel nucleo

Hep-2: Nucleolare Fluorescenza omogenea dei nucleoli, associata ad una colorazione e velata del resto del nucleo

Punteggiato a grandi granuli > 1:1280 (SmRNP)

Punteggiato a piccoli granuli > 1:1280 (SSA+SSB)

Centromerico 1:1280

Ribosomi

Granulare citoplasmatico 1:1280 (AMA)

Anticorpi Antinucleo (ANA) IFI su cellule Hep-2 Quadri fluoroscopici Nucleari Citoplasmatici omogeneo (DNA, Istoni) punteggiato (Jo1) granulare (RNP, Sm, SSA, SSB) mitocondriale (PiruvatoDH) nucleolare (Scl-70) ribosomiale (RNP) centromerico ( CENP A.B.C) citoscheletro(actina,vimentina) Mitotici fibre del fuso mitotico (tubulina) poli del fuso mitotico (NuMa) centrioli (enolasi)

ANA- IFI su cellule Hep-2 TEST POSITIVO INDAGINI DI 2°LIVELLO

AUTOANTICORPI CIRCOLANTI: INDAGINI DI 2°LIVELLO ANA+ Indagini di II° livello Ab anti-ENA Ab anti-dsDNA

Anti-dsDNA La determinazione degli autoAb anti-dsDNA è raccomandata in ogni caso in presenza di sintomi riferibili a LES, ovvero in caso di positività degli ANA ad un titolo > 1:160

Anti-dsDNA LES : 60 % IN FASE ATTIVA 25 % IN FASE QUIESCENTE 80 % NEL LES CON NEFROPATIA

Anti-dsDNA In fase diagnostica, si consiglia per la ricerca degli autoAb anti-dsDNA il metodo RIA metodo IFI su Crithidia luciliae, alla diluizione iniziale del siero 1:10 ( elevata specificità ) metodo ELISA (“purchè i risultati positivi vengano successivamente confermati con il metodo IFI”)

IFI-ELISA IFI - ELISA * elevata sensibilita’e riproducibilita’ *standardizzazione * facilita’di esecuzione *automatizzazione * difficile standardizzazione * oggettività * soggettivita’ * limitato numero di * costo ridotto antigeni nel coating

Crithidia luciliae

Crithidia luciliae Un campione è positivo se il kinetoplasto è più fluorescente del controllo negativo (anti ds-Dna detection)

ANA-ELISA alta processività oggettività standardizzazione quantizzazione delle singole componenti antigeniche con un ruolo patogenetico accertato

Antigene nuclei di cellule HeLa antigeni purificati con cromatografia di affinità da nuclei di cellule HEp-2 antigeni ricombinanti estratti nucleari + antigeni ricombinanti

ELISA-punti critici Qualità antigene impiegato Qualità della soluzione di ‘coating’ Polarizzazione del legame alla fase solida Efficacia dell’operazione di lavaggio Efficienza del fotometro Range di normalità – Cut-off

ENA-PROFILE ELISA, altamente sensibile, quantitativa, test di screening non sufficiente Western-blot, qualitativo, rivela epitopi rari, utile nell’approfondimento diagnostico Immunoblot Dot-blot

METODI ANALITICI Metodi ELISA Metodi DOT blot Micropozzetti di polistirene come fase solida Procedure di lavaggio più intensi Rilevazione del segnale (assorbanza) tramite fotometri Misurazioni semi-quantitative Supporti di cellulosa come fase solida Procedure di lavaggio più ‘gentili’ Rilevazione del segnale (banda di colorazione) ad occhio Misurazioni qualitative E

Anti-Sm Pattern fluoroscopico : punteggiato Associazione clinica : LES Spec: 99% Sens: 15-30%

Anti-SSA/Ro e anti-SSB/La Pattern fluoroscopico : punteggiato fine Associazione clinica : 50-80% Sindrome di Sjogren (sub.52Kda) 30-50% LES (sub.60Kda) BAV

ANTI-RIBOSOMIALE Sul tessuto epatico danno una fluorescenza intensa del citoplasma degli epatociti di tipo grossolanamente granulare;colorano le cellule dei tubuli renali sia prossimali che distali. Specificità 99% 10-20% LES 40-80% NEUROLES

ANTI-MITOCONDRIO(AMA) Bersaglio: PROTEINE DEL COMPLESSO PIRUVATO- DEIDROGENASI Importanti nella diagnosi di cirrosi biliare autoimmune. Fluorescenza grossolanamente granulare nel citoplasma perinucleare dei tre tessuti, in particolare nelle sezioni di rene appare piu’intensa la fluorescenza dei tubuli distali rispetto a quelli prossimali.

FR CLASSICO

ASSOCIAZIONE FR CLASSICO - MALATTIA AR 70 % SSJ 80 % CRM 100 % ALTRE MAS 5 - 30 %

FR CLASSICO Considerato un test specifico per l’AR la sua ricerca non ha validità assoluta specie in fase precoce per le seguenti considerazioni : 1.frequentemente negativo nelle AR iniziali 2.soffre di troppo facili false positività in condizioni non reumatoidi

FR CLASSICO PUO’ ESSERE POSITIVO ANCHE : MALATTIE INFETTIVE SARCOIDOSI MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE MALATTIE EPATICHE MALATTIE POLMONARI 10 % DELLE PERSONE DI ETA’ > 60 ANNI

QUINDI: LA PRESENZA DEL FATTORE REUMATOIDE CLASSICO NON E’ ASSOLUTAMENTE SINONIMO DI AR IL VALORE PREDITTIVO PER AR DI UN FATTORE REUMATOIDE POSITIVO E’ DI APPENA IL 3 % ! DIAGNOSI DI AR RIMANE ANCORA UNA DIAGNOSI ESSENZIALMENTE CLINICA, IN QUANTO A TUTT’OGGI NELLA PRATICA CLINICA NON SI RICERCA ALCUN AUTOANTICORPO SENSIBILE E SPECIFICO PER L’AR RECENTEMENTE E’ STATO INDIVIDUATO UN AUTOANTICORPO CHE SEMBRA ESSERE ABBASTANZA SENSIBILE E SPECIFICO DELL’A R

DIAGNOSTICA DEL FATTORE REUMATOIDE 2 Metodi Waaler Rose (Immunoagglutinazione su vetrino) Test immunoenzimatici (ELISA)