HPLC Laboratorio di Chimica Organica 2 - Prof. Cristina Cimarelli L27 - CHIMICA - AA 2014-2015

HPLC qualitativa & quantitativa colonne riutilizzabili non distruttiva velocità di analisi qualitativa & quantitativa buone risoluzioni alta sensibilità versatilità

HPLC colonne impaccate con particelle di piccole dimensioni alte pressioni applicate in testa alla colonna alta efficienza High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography

HPLC LC HPLC LC HPLC Lunghezza della colonna 23 cm Diametro della colonna 1.2 cm Quantità di campione 0.5 mL Dimensione delle particelle 100 mm 10 mm Pressione 0.5 psi 400 psi Tempo 3h 10’ 20’ Velocità di flusso 0.2 mL/min 2 mL/min Risoluzione incompleta completa

PRE-COLONNA e/o COLONNA HPLC - STRUMENTAZIONE RISERVA DI SOLVENTE SISTEMA DI GRADIENTE può contenere accessori per riscaldare degassare agitare il solvente o la miscela di solventi 300-7000 psi  20-480 atm 1 psi = 0.068 atm = 6.894 kPa POMPE INIETTORE PRE-COLONNA e/o COLONNA MISURATORE DI FLUSSO REGISTRATORE RIVELATORE COLLETTORE DI FRAZIONI DATA SYSTEM

HPLC - STRUMENTAZIONE REQUISITI DELLO STRUMENTO: massima resistenza alla corrosione resistenza ad alte pressioni di testa e flussi elevati volumi morti minimi in connessioni, iniettore, rivelatori velocità di flusso costante con precisione < 0.2%  tR

HPLC - STRUMENTAZIONE POMPA: è fondamentale per ottenere una velocità di flusso costante velocità costante riproducibilità dei tR Le pompe a pistone sono le più utilizzate, ma producono un flusso pulsato, che interferisce con i rivelatori. Di solito i cromatografi con pompe a pistone sono muniti anche di uno smorzatore di flusso. Alternativamente, per smorzare il flusso, si mettono alcuni pistoni in serie, con moti sfalsati, così da mediare l’uscita del flusso.

composizione della fase mobile costante nel tempo HPLC - STRUMENTAZIONE GRADIENTE isocratica composizione della fase mobile costante nel tempo eluizione gradiente composizione della fase mobile variabile apparecchio di miscelazione + pompa 1 pompa x ogni solvente + camera di mescolamento

automatizzato x analisi in serie HPLC - STRUMENTAZIONE INIETTORE diretta in colonna o pre-colonna iniezione con valvole automatizzato x analisi in serie caricamento = trasferimento del campione nel loop per portarlo alla pressione di esercizio del cromatografo iniezione = la rotazione di una valvola devia il flusso della fase mobile nel loop e trasporta il campione in colonna

fasi con particelle di forma irregolare - 20-60 mm COLONNE HPLC - STRUMENTAZIONE COLONNE ad acqua contiene forno termostatico la colonna il rivelatore  proprietà dell’analita influenzate da T ad aria fasi con particelle di forma irregolare - 20-60 mm COLONNE fasi con particelle microsferiche - 3-10 mm Uso Diametro (cm) Lunghezza (cm) Quantità di campione Microanalisi 1-2 3-7 10-50 mg Analisi 3-5 10-25 100-200 mg Separazione 10-20 25-50 1-200 mg

rivelano solo composti con determinate caratteristiche HPLC - STRUMENTAZIONE RIVELATORI UNIVERSALI misurano variazioni delle proprietà del’eluato dipendenti dalla composizione indice di rifrazione calore d’assorbimento ionizzazione di fiamma UV fluorescenza elettrochimici conduttività elettrolitica polarografici RIVELATORI SELETTIVI (x classi di composti) misurano proprietà chimiche e/o fisiche del soluto SPECIFICI rivelano solo composti con determinate caratteristiche distruttivi non distruttivi radioattività chirali

HPLC versatilità elevata sensibilità monitoraggio continuo dell’effluente della colonna linearità di risposta RIVELATORE basso livello di rumore insensibilità alle variazioni di flusso e temperatura risposta a tutti i tipi di composti linea di base stabile

caratteristiche costruttive HPLC LINEARITA’ accuratezza del’analisi quantitativa RUMORE perturbazione della linea di base massima sensibilità concentrazione minima rivelabile dell’analita RIVELATORE SENSIBILITA’ ASSOLUTA valore minimo della grandezza misurata che determina la deflessione a fondo scala del registratore, ad un dato valore del rumore di fondo  caratteristiche costruttive RELATIVA minima concentrazione di soluto eluito che può essere chiaramente distinta dal rumore SEGNALE/RUMORE = 2  PICCO IDENTIFICABILE

Sensibilità assoluta (rumore 1%) HPLC RIVELATORI Tipo di rivelatore Sensibilità assoluta (rumore 1%) Sensibilità relativa Indice di rifrazione 10-5 5 x 10-7 g/mL Assorbimento UV 5 x 10-3 10-9 - 5 x 10-10 g/mL Calore di adsorbimento 10-9 g/s Fluorescenza - 10-9 g/mL Conduttività 5 x 10-2 10-8 g/mL Polarografia 2 x 10-8 Ionizzazione di fiamma 10-11

Rivelatore a indice di rifrazione HPLC l’indice di rifrazione del solvente cambia in presenza di un soluto Rivelatore a indice di rifrazione  stabile  risente delle variazioni di flusso, di pressione e di temperatura non distruttivo non è utilizzabile in gradiente Analisi di carboidrati  senza particolari cromofori  non contengono ioni  non danno fluorescenza Alcoli alifatici Prodotti di idrolisi degli amidi

HPLC assorbimento dell’analita nella regione UV-Vis Rivelatore UV solventi adeguati  stabile  risente delle variazioni di flusso, di pressione e di temperatura non distruttivo non è utilizzabile in gradiente buona linearità insensibile al flusso può essere usato con flussi pulsati (gradiente) poco sensibile a T  A l fissa (254 nm - lampada al mercurio - più sensibile, meno versatile)  A l variabile (190-350 nm - lampada al deuterio - continuo o stopped) purezza = rapporto di assorbimento a l diverse  A diode array (190-350 nm - lampade a deuterio o xeno spettro UV in continuo dell’eluato) identificazione dei soluti l tipiche

Rivelatore di fluorescenza HPLC composti o derivati fluorescenti più sensibile, meno versatile Rivelatore di fluorescenza di solito abbinato ad UV o indice di rifrazione  l scelta in base allo spettro di fluorescenza dell’analita  usato in medicina legale perché estremamente sensibile

Silice non derivatizzata HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI STABILITA’ TERMICA FASE STAZIONARIA INERZIA VERSO SOLVENTI & SOLUTI Silice non derivatizzata silanolo disattivato con acqua isolato (più attivo) legato silossano (idrofobico) FASE DIRETTA stabilità in un intervallo limitato di pH variazione dell’acidità da tipo a tipo  ritenzione di soluti acidi e basici adsorbimento irreversibile di analiti polari  silici funzionalizzate controllo stretto delle quantità di H2O per avere maggiore riproducibilità riequilibrio lento al cambiamento della fase mobile

HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI Silice derivatizzata fase inversa silice organosilano +  X3-nSiRR’n 1 ≤ n ≤ 3 R = n-alchile, fenile, cianoalchile R’ = metile X = gruppo uscente: cloro, alcossi, dialchilammino

HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI legami a idrogeno interazioni dipolo-dipolo con composti polari gruppi silanolo: debolmente acidi perdita di risoluzione endcapping = seconda funzionalizzazione con organosilani con gruppi più piccoli (TMSCl, HMDS) SVANTAGGI idrolisi dei legami silossanici a bassi pH 2 < stabilità < pH 8 fasi polimeriche (polimeri stirene-divinilbenzene) dissoluzione della silice a pH elevati

HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI IDROFOBICO SOLVOFOBICO Repulsione della fase acquosa mobile piuttosto che interazione con la fase fissa meccanismo di ritenzione Contengono una maggior proporzione di solvente organico Fasi mobili non polari Fasi forti Inducono il soluto a legarsi alla fase stazionaria tempi di ritenzione lunghi Fasi mobili polari Fasi deboli Influiscono sui tempi di ritenzione, perché le molecole di soluto ionizzate interagiscono più fortemente con la fase mobile e vengono eluite prima. Variazioni di Ph

diametro e lunghezza della colonna HPLC SEPARATIVO cromatografia analitica velocità risoluzione cromatografia preparativa velocità risoluzione industriale capacità di caricamento diametro e lunghezza della colonna quantità di componente isolata per unità di tempo dimensioni delle particelle densità di impaccamento dipende da dimensioni della colonna velocità di flusso SCALA ANALITICA 1-10 mg dipende da SCALA SEMIPREPARATIVA 100-200 mg SCALA PREPARATIVA 0.5-1 g  1 Kg

HPLC COLONNE Diametro interno 2 mm 8 mm 23 mm Separazione Difficile (a < 1.2) 1 mg 20 mg 100 mg Facile (a > 1.2) 10-50 mg 200-1000 mg 1-5 g

volumi iniettati troppo alti HPLC SEPARATIVO campioni poco solubili volumi iniettati troppo alti sovraccaricamento della colonna campioni solubili campioni troppo concentrati campione poco solubile nella fase mobile precipitazioni in colonna COSTANZA DEI VOLUMI DI RITENZIONE DI VOLUME sovraccaricamento della colonna il soluto si distribuisce lungo la fase stazionaria la banda si allarga DI MASSA effetti di dispersione