Genoma Umano e malattie genetiche lezione 3-4 Martedì 5 Maggio

le regioni regolative non ci sono molti esempi già studiati il primo classico è quella del locus della  globina una Locus Control Region fa parte di un cluster genetico a livelli superiori mancano degli esempi più chiari potrebbero mancare oppure sono da scoprire

regioni regolative con funzione bidirezionale per ora gli esempi più chiari stanno nelle Regioni Regolative costituite da Enhancers questo livello è molto vicino alla attività trascrizionale dei geni che controllano e che costituiscono il cluster genico questo tipo di controllo può essere bidirezionale: TOP - DOWN BOTTOM - UP

esempio del cluster delle Ig la risposta immunitaria è data dall’interazione di molte cellule e di molte funzioni collegate con la regolazione dell’espressione delle Ig sono collegate molte altre funzioni che sono coregolate o coordinate il coordinamento deve prevedere: - interazioni intracellulari - “ extracellulari intracellulari: sopravvivenza, selezione, controllo moltiplicativo extracellulari: interazioni con le altre cellule della risposta immune “cross talking” tramite interleukine

partiamo da un esempio un sistema piuttosto noto ed interessante la regolazione delle immunoglobuline e dei linfociti B la maturazione e l’attivazione vanno di pari passo sistema multifattoriale esempio di interazione genoma ambiente

the study of the 3’RR TOR VERGATA different aspects of the study of a regulatory region interactions of a regulatory region: unidirectional flux ? the jerarchy of the regulation the genome is controlled by epigenetic events interactions of genome and environment these events open the possibility of a non univocal flux needs to be bidirectional

interactions and jerarchy TOR VERGATA interactions and jerarchy epigenetic modifications of the region: nucleosome remodeling; methylation

tools for a RR study TOR VERGATA the tools : - evolutionary conservation and transformations - polymorphisms in humans (any kind!) - transgenic models in mouse - in vitro assays with cell lines (mouse and human)

“La regione regolativa 3’ della catena pesante delle Ig: struttura e funzioni” La tragedia dei linfociti B nati per morire all’ 80% Il 20 % che sopravvive svolge il suo ruolo solo nella vecchiaia (a parte le memory cells che sono minoranza) - processi di maturazione ed interazioni cluster delle IgH (heavy) e struttura della regione regolativa processo evolutivo instabilità e regioni duplicate nell’uomo la regione IgH3’RR duplicata l’enhancer HS1,2-A/B è duplicato e polimorfico studio dell’attività tramite geni reporter in cellule trasfettate studio dei fattori che legano la sequenza enhancer EMSA

cascata di fosfatasi e kinasi nel processo di maturazione dei linfociti B si verifica una cascata di segnali CD45 Rap 1 MAPKs prima degli eventi di riarrangiamento messo in moto dal preBCR

riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE Locus Catene leggere V-J processing VJ riarrangiato VJ riarrangiato VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana Locus Catene pesanti D-J processing V-DJ processing VDJ riarrangiato VDJ riarrangiato CELLULE B maturazione Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

maturazione II Locus Catene leggere Locus Catene pesanti CELLULE B ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE VJ riarrangiato VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche Plasmacellule Cellule Memoria Cellule B attivate Centrociti VDJ riarrangiato. Le catene m prodotte in forma di membrana Switch isotipico a Cg, Ca o Ce. Ipermutazione somatica Switch isotipico. Ipermutazione somatica. Catene pesanti prodotte in forma di membrana Switch isotipico. Catene pesanti prodotte in forma secreta. VDJ riarrangiato Catene m prodotte in forma secreta. maturazione II Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

induzione dello switch PLASMACELLULE Cellule B proliferanti Cellula B attivata (centroblasto) IL-2; IL-4; IL-5; IgG2a o IgG3 IgA o IgG2b IgE o IgG1 IgM IFN-g IL-4 TNF-b Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5; Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-g; TNF-b; Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR) cellule denditriche e T-helper

ricombinazione Switch region: IgM Ricombinazione class switching (CSR) VH DH JH CH Ricombinazione V(D)J Switch region: V(D)J m d g3 g1 2b 2a e a Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb IgM Ricombinazione class switching (CSR) Il filamento non stampo è ricco in G 2a V(D)J m e a Sm, Sa ed Se hanno un repeat di 5 bp. Sg ha un repeat di 49 bp. d 2b IgE g3 g1 Risultato dello switch Circolo exciso Fig. Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.

mappe dei loci IgH e IgL LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig Locus catena leggera l Locus catena leggera k Locus catena pesante Cromosoma 22 Cromosoma 2 Cromosoma 14 LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig

Riparazione dei breaks il riarrangiamento A B C D F E Trascrizione regione S RNA editing ? AID? CSR ricombinasi? Riconoscimento delle regioni S accessibili Formazione di breaks al DNA Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili Formazione di strutture secondarie (R loop?) Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA Riparazione dei breaks S c-myc una regione S due regioni S Switch su un altro cromosoma traslocazione Class switching recombination Delezioni intra-switch 2 1 Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR). Activation-induced cytidine deaminase (AID)

espressione nelle  fasi di sviluppo Sviluppo dei linfociti B indipendente dall’ antigene pro-B “committed” esprimono B220 (CD45) e anche CD 43, TdT terminal deossitransferasi, RAG-1, RAG-2, CD19 pre-B diminuzione di CD43, RAG-1 e 2, scomparsa di TdT, riarrangiamento della catena pesante, pBCR pre B cell receptor, riarrangiamento produttivo della catena leggera espressione di membrana di IgM Trascrizione dei surrogati delle catene leggere  Ig / formano il pre-B cell receptor complex di membrana essenziale per le fasi di sviluppo (CD45 - B220 - fosfotirosin fosfatasi PTPase integra i segnali durante lo sviluppo, non necessario per la linfopoiesi, forse è un’attività ridondante) CD19 interagisce con le tirosin-kinasi, non è essenziale, però favorisce l’entrata nel circolo periferico

maturazione nel germinal center avviene in associazione intima con cellule THelper e cellule dendritiche del follicolo : -proliferazione clonale -ipermutazioni somatiche -selezione di affinità (self ed altro) -selezione negativa -switch isotipico

strutture regolative della trascrizione e indirettamente del riarrangiamento delle IgH promotori dei geni V enhancer intronico iE ECS (evoluz. conserved seq.) intervening 5’ CH genes 3’ Ig heavy 3’ enhancer complex o regulat. region k intronico iE 3’E  light chain E si attivano per la trascrizione sterile insieme a RAG1/2 con altri enzimi del riparo, variazione di metilazione e di struttura cromatinica, gli enhancers necessari anche per la ricombinazione V(D)J I riarrangiamenti sono regolati da fattori di trascrizione ubiquitari e tessuto specifico

evoluzione delle Ig Cluster organization: Translocon organization: Sharks (hom shark)- multiple loci of each type except IgMgj Channel catfish (700 - 800kb) lungfish coelacanths Xenopus (~800 kb) Duch and chicken Cattle Rabbit Mouse Human IgM IgNAR IgW IgM1gj IgY IgX E (V DDJ Cm)200 (V DDDJ NAR)>2 (V DD J C)<10 (VD J Cm1gj)<10 (multiple chromosomes) (not L chain-associated) many V’s VDJ D,J’s Cm 100-200 V’s D’s 9J’s Cm Cdsec Cdmem several V’s Presumptive arrangement D, J’s C VD’s(>100) J’s V’s(100-200) D(>15) J(8-9) Sm C  S C  S pseudoV’s(~100) V D’s J C a Sa V’s(~15) D(>3) J(2) Sm Cm Sg3 Cg3 Sg1 Cg1 Sg2 Cg2 Se Ce Sa Ca Sd Cd V’s(~100) D(14) J(6) Sa Ca Sg Cg J(4) S Cg3 S Cg1 Cd S Cg2b S Cg2a S Ce S Ca D(27) S  S Ca1 S Ca2 S Cg2 S Cg4 350 kb 200 kb 13 Ca genes 150 kb (cattle) 48 kb (duck); 80kb (chicken) Transcriptional orientation ? 7 geni costanti forse 13 geni costanti 8 geni costanti 10 geni costanti dipnoi crossopterigi (latimera) teleostei evoluzione delle Ig

cluster Ig topo-uomo centromero telomero trascrizione Mouse Igh cluster Chromosome 12 Human Igh cluster Chromosome 14 12F1 14q32.33 mta1 JDV crip2 crip1 hole a e g2a g2b g1 g3 d m Em J D V a2 g2 a1 e g4 g elk 2.1 hs4 hs1.2 hs3 20bp 3’a1 elk 2.2 3’a2 hs 4 hs 3B hs 1,2 hs 3A hs 3 BAC199M11(AF450245) 86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,065,000 86,070,000 86,075,000 86,060,000 85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500 trascrizione (rischio riarrangiamenti) IgH3’RR-A IgH3’RR-B