Esame batteriologico Finalità: Ricercare in modo rapido ed accurato gli agenti responsabili di processi infettivi Identificarli e determinare la loro sensibilità agli antibiotici

normale popolazione residente opportunista I batteri sono ubiquitari: si adattano e colonizzano qualsiasi ambiente NORMALE FLORA RESIDENTE Vi è un reciproco adattamento e vantaggi per l’ospite (sviluppo del sistema anticorpale, mobilità intestinale, minore sensibilità ad infezioni batteriche e micotiche) Commensalismo: microrganismo e ospite utilizzano le stesse sostanze nutritive senza influenzarsi a vicenda. Simbiosi: scambio di prodotti che una dei due è incapace di sintetizzare (batteri intestinali che producono vitamine). Parassitismo vero: il microrganismo vive a spese dell’ospite provocando danni più o meno gravi. OPPORTUNISTA Commensale o saprofita che in determinate circostanze (siti corporei, immunodepressione, organismo defedato, ecc.) può presentare caratteri di patogenicità. PATOGENO Batterio in grado di invadere i tessuti di un organismo e di moltiplicarsi danneggiando il normale funzionamento dell’organismo ospite con produzione di sostanze tossiche. Invasività: moltiplicazione in vivo Virulenza: grado di patogenicità patogeno

metodi rapidi di identificazione preliminare Microscopici: esame a fresco: vetrino + coprioggetto vetrino a goccia pendente colorazioni: Gram, Blu di metilene inchiostro di china Immunologici: reazione Anticorpo/Antigene Biologia Molecolare Un esame colturale standard ha tempi di processazione di 24 – 72 o più ore, talvolta, particolari esigenze cliniche richiedono una risposta , preliminare, in tempi più rapidi possibile. Metodi rapidi di indagine preliminare sono: Microscopici: esame a fresco: (vetrino + coprioggetto). (es. miceti, mobilità di alcuni batteri) vetrino a goccia pendente (utile per l’osservazione della mobilità dei batteri) Colorazione di gram: permette di fornire, in tempi rapidi, la presenza di batteri gram positivi o gram negativi, dato già importante per cominciare una terapia antibiotica. Blu di metilene: permette un osservazione più accurata di quei batteri, specie gram negativi, che col gram potrebbero non risultare ben visibili sullo sfondo rosso delle altre cellule. Inchiostro di china: utile per la ricerca rapida del criptococco (micete) e del pneumococco (entrambi provvisti di capsula) nel liquor. Immunologici: Sfruttano la reazione tra anticorpo specifico (contenuto nel siero reattivo) e l’antigene (proprio del betterio). (es. antigenerachia criptococco, pneumococco) Biologia Molecolare

scelta dei terreni, semina dipende dalla sede dell’infezione e dell’atteso patogeno responsabile Con la recente Certificazione ISO 9002 si sono introdotte le Procedure Operative che definiscono i Protocolli di Semina (che per altro già esistevano), questi stabiliscono per ogni materiale un corredo di terreni di coltura. Tale corredo è definito in funzione: Della Normale flora residente Dei Patogeni epidemiologicamente più frequenti in quel materiale Degli Opportunisti probabili in funzione della tipologia di paziente e di materiale Della necessità di usare il minor numero di terreni solidi e liquidi possibile Di specifiche richieste da parte del medico curante (germi non comuni, o precedenti isolamenti)

terreni di coltura Terreni solidi in piastra: arricchiti selettivi differenziali Terreni solidi in provetta Terreni liquidi TERRENI SOLIDI IN PIASTRA Il terreno base è l’agar, una volta estratto da alghe ora sintetico, il suo potere nutritivo è praticamente nullo, serve solo come agente solidificante. Terreni arricchiti: Agar base più aggiunta di sostanze nutritive particolari o fattori di crescita, viene usato per i germi esigenti. Le sostanze nutritive più usate sono il sangue defribinato di montone o coniglio, liquido ascitico, fattori di crescita quali vitamine o amminoacidi. (A.columbia, A.cioccolato) Terreni di arricchimento: (liquidi) Contengono sostanze che favoriscono la crescita del germe ricercato, senza sfavorire particolarmente gli altri (es: brodo selenite) Terreni selettivi: Contengono sostanze che non ostacolano lo sviluppo del germe ricercato mentre impediscono la crescita di altri germi eventualmente presenti nel materiale. (A.columbia CNA, MSA, Hektoen, Bile) Terreni differenziali: Contengono sostanze che rilevano le attività biochimiche caratteristiche dei germi (es. fermentazione, idrolisi) (A.lattosio, cromogeni). Alcuni terreni selettivi (MSA, Bile, Hektoen) sono anche differenziali. Terreni cromogeni: Terreni solidi in provetta: Sono gli stessi (i più comuni) che si trovano in piastra, vengono utilizzati per la conservazione di ceppi batterici. Terreni liquidi: Sono i terreni più antichi usati in batteriologia (brodo di carne). Non sono idonei per colture pure, servono per l’arricchimento di materiali con cariche batteriche molto scarse.

I terreni possono essere acquistati già pronti oppure la preparazione può avvenire in laboratorio con polveri che si trovano in commercio Le istruzioni per la preparazione sono riportate sulla confezione o su appositi manuali per terreni particolari e più complessi

Substrati solidi (piastre Petri)

semina 1 2 3 4

Terreni nutrienti permettono la crescita della maggior parte dei microrganismi Terreni selettivi permettono la crescita solo di alcune specie Terreni differenziali permettono la discriminazione di una specie dall’altra grazie ad opportuni indicatori

Agar Sangue Terreno nutriente con 5 % sangue di montone non permette la crescita di Haemophilus, Neisseria, micobatteri, Bordetella, Francisella, Legionella Streptococcus pyogenes

emolisi parziale, viridante a totale b

Agar cioccolato Terreno nutriente e selettivo con sangue di cavallo (il sangue è fatto scaldare a 80°C per permettere la rottura dei globuli rossi e la liberazione nel terreno di ematina e NAD) Permette la crescita della maggior parte dei batteri ma in particolare dell’ H. influenzae e delle Neisserie.

Mc Conkey Selettivo per enterobatteri Sali biliari e cristalvioletto inibiscono la crescita di batteri gram positivi Lattosio e rosso neutro consentono di differenziare gli enterobatteri fermentanti (es. E. coli) dai non fermentanti (es. Acinetobacter)

Enterobatteri non fermentanti Enterobatteri fermentanti

Agar sale-mannitolo Selettivo/differenziale Contiene NaCl, mannitolo, rosso fenolo Utilizzato per isolare stafilococchi e streptococchi, inibisce la crescita della maggior parte degli enterobatteri. Staphylococcus aureus

Agar sale-mannitolo

Agar Thayer Martin Terreno selettivo per Neisserie patogene (N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. lactamica), gli altri batteri sono per la maggior parte inibiti. Contiene vancomicina (3mg/l), colistina (7.5 mg/l), nystatina (12.53 mg/l), trimetoprim (15.3 mg/l)

Agar Shigella/Salmonella (XLD) Agar selettivo/differenziale per patogeni enterici Contiene xiloso, lisina, desossicolato. Salmonella spp. Klebsiella pneumoniae

Sabouraud agar Isolamento miceti Aggiunta di ampicillina 0.5% e cloramfenicolo 2% Per la differenziazione di C. albicans dalle altre specie si aggiunge inoltre fenolftaleinadifosfato 5% e verde metile 0.5%

Terreni liquidi Tioglicolato: agente riducente che allontanando l’ossigeno dal terreno soddisfa le esigenze nutritive della maggior parte dei batteri anaerobici. Brain heart: contiene estratti di cuore, cervello, peptone, destrosio, NaCl. È particolarmente nutritivo per la crescita della maggior parte dei microrganismi inclusi streptococchi e pneumococchi. Triptyc soy broth: contiene triptone, soia, NaCl. Brodo selenite: contiene triptone, lattosio, selenite. È utilizzato per favorire la crescita di Shigella e Salmonella. Mueller Hinton: utilizzato per i saggi di sensibilità agli antibiotici.

Terreni cromogeni Terreni differenziali Contengono sostanze che rilevano le attività biochimiche caratteristiche dei germi (es. fermentazione, idrolisi) (A.lattosio, cromogeni). Alcuni terreni selettivi (MSA, Bile) sono anche differenziali. L’introduzione dei nuovi terreni cromogeni ha rivoluzionato l’approccio del microbiologo ai terreni differenziali.

colorazioni La colorazione in batteriologia, introdotta verso la metà del XIX secolo, è stata in gran parte responsabile dei grandi progressi che si sono verificati nella microbiologia. I coloranti derivano da tre composti organici: C6H5-CH3 toluene C6H5-OH fenolo C6H5-NH2 anilina e sono divisi in due grandi categorie: acidi e basici, i batteri sono basofili quindi vengono usati coloranti basici I batteri hanno dimensioni molto ridotte ed un indice di rifrazione vicino a quello dell’acqua, per cui per renderli visibili sono necessarie le colorazioni. La classificazione dei coloranti è molto complessa, generalmente si usa definirli “basici” o “acidi” non tanto per il pH delle loro soluzioni ma piuttosto se una porzione della loro molecola sia anionica o cationica, i coloranti in batteriologia sono quindi utilizzati in soluzione acquosa come sali. I batteri, per l’alto contenuto di acidi nucleici, sono altamente basofili per cui si utilizzano coloranti “basici” e derivano tutti dall’anilina. Le colorazioni fondamentali sono di tre tipi: Colorazione progressiva: il colorante utilizzato è molto diluito, il lavaggio è tempestivo, la colorazione è quindi molto delicata. Vengono evidenziate le diverse affinità per il colorante delle varie strutture della cellula batterica. (poco usato) Colorazione regressiva: la cellula batterica viene ipercolorata (colorante piuttosto concentrato, tempi abbastanza lunghi), quindi si decolora con liquidi differenziatori (alcool, acetone), vengono così decolorate le parti di cellula batterica che hanno meno affinità per il colorante e che vengono a loro volta colorate con un colorante di contrasto (Gram). Colorazione metacromatica: in generale il colorante impartisce alle cellule batteriche il colore che gli è proprio ma talvolta possono venire impartite colorazioni diverse. Le colorazioni usate per il bacillo difterico sono metacromatiche in quanto colorano, diversamente dal corpo cellulare, le granulazioni di volutina che il bacillo presenta al suo interno.

colorazioni blu di metilene Ziehl-Neelsen violetto di genziana (Gram) metacromatica Blu di Metilene: Colorazione semplice monocromatica, agisce delicatamente e senza tendenza all’ipercolorazione. Molto utile nella colorazione direttamente sul materiale (es. liquor) per quei batteri (Haemophylus, Neisseriae) gram negativi che contrasterebbero poco (rossi sul rosso dei globuli bianchi o rossi) nella colorazione di Gram. Ziehl-Neelsen: Bacillo di Koch Gram: È la colorazione più usata in batteriologia, si fonda sulla proprietà di alcuni coloranti (cristalvioletto, violetto di genziana, ecc.) di combinarsi con lo iodio formando composti non dissociabili con liquidi differenziatori (alcool, acetone). La parete cellulare di alcuni batteri hanno una speciale affinità per questa combinazione ed una volta colorati non cedono il colore se trattati con decoloranti (gram positivi) altri batteri perdono la colorazione e possono quindi assumerne un’altra (gram negativi). Metacromatica: Vedi pagina precedente.

colorazione di GRAM blu / violetto gram positivi rosso gram negativi Questa immagine è significativa, per quanti potranno vederla a colori, per comprendere meglio il significato visivo di gram negativo e, soprattutto, di gram positivo. Utile anche per capire quanto sia soggettivo il significato di “blu” quando si parla di colorazione di gram.

gram positivi Bastoncini (lattobacilli)

gram positivi stafilococchi Stafilococchi Cocchi (rotondi) gram positivi, disposti a grappolo

gram positivi streptococchi Streptococchi: Cocchi (rotondi, ovoidali, lanceolati) gram positivi disposti a catenella. Le catene, in vetrini fatti da colonia, possono presentarsi non molto lunghe

gram negativi bastoncini Bastoncini gram negativi: La loro osservazione non permette, come per i gram postivi, una discriminazione del genere

Determinazione della sensibilità dei germi agli antibiotici antibiogramma Determinazione della sensibilità dei germi agli antibiotici diluizione in provetta diffusione in Agar (Kirby-Bauer) (metodo standard) Antibiotico: sostanza in grado di inibire la crescita o uccidere i microrganismi (batteriostatici, battericidi). I metodi per la determinazione della sensibilità agli antibiotici sono: Diluizione in provetta: diluizioni scalari dell’antibiotico in provetta. Poco usata (escluso Koch). Diffusione in agar: metodo Kirby-Bauer con dischetti antibiotati che diffondono l’antibiotico su un terreno (Mueller-Hinton), la categoria di sensibilità è ricavata dall’alone di inibizione di crescita intorno ai dischetti. Sistemi automatici.

Mueller-Hinton agar Estratto di carne, casaminoacidi,lievito Utilizzato per saggiare la sensibilità dei microrganismi agli antibiotici

Kirby Bauer d2 d Strumento per la deposizione dei dischetti antibiotati. Risultato dopo incubazione: Il diametro dell’alone di inibizione di crescita, correlato con l’antibiotico, definisce la categoria Resistente, Intermedio, Sensibile

E-test: L’antibiotico non è in concentrazione unica come nei dischetti ma in concentrazioni scalari e note. Con questo metodo è possibile definire la MIC E-test

E’ ancora affetto da infezione o è diventato un portatore sano? Un paziente ospedalizzato può veicolare un ceppo nosocomiale per oltre 6 mesi dalla dimissione E’ ancora affetto da infezione o è diventato un portatore sano? Scanvic et al, 2001; Marchese, 2004

Metagenomics As a result, the genetic and biological diversity of microorganisms is an important area of scientific research. Unfortunately, scientists are able to grow LESS THAN 1% of all microorganisms observable in nature under standard laboratory conditions. This leaves scientists unable to study more than 99% of the biological diversity in the environment To understand the biochemical processes of life, it is often easier to study them in a simple system (like a microorganism) instead of a complex one (like humans). Microorganisms have many of the same properties as more complex organisms such as amino acid biosynthesis. They also contain unique properties such as the ability to degrade waste products. As a result, the genetic and biological diversity of microorganisms is an important area of scientific research. Unfortunately, scientists are able to grow less than 1% of all microorganisms observable in nature under standard laboratory conditions. This leaves scientists unable to study more than 99% of the biological diversity in the environment. Metagenomics is a new field combining molecular biology and genetics in an attempt to identify, and characterize the genetic material from environmental samples and apply that knowledge. The genetic diversity is assessed by isolation of DNA followed by direct cloning of functional genes from the environmental sample

VBNC: attivazione di uno stato vitale ma non coltivabile Internalizzazione: b-lattamici e aminoglicosidi non entrano all’interno delle cellule (Ig, PMN) Induzione di forme filamentose

Rappresentazione schematica della divisione di cellule bastoncellari o coccoidi I batteri si dividono per scissione binaria Il tempo di divisione (generazione) della cellula batterica è molto variabile e dipende dalla specie e dal terreno di coltura Ad es. E. coli può dividersi ogni 20 min, in una notte oltre 20 generazioni (circa 500 anni per un uomo) M. tuberculosis ha un tempo di generazione di circa 24 ore

Durante questo periodo molti caratteri di patogenicità e virulenza e di resistenza agli antibiotici possono essere persi specie se veicolati da plasmidi

L’intenso uso di antibiotici non incide solamente sull’evoluzione delle resistenze, ma anche sulla fisiologia dei microrganismi

Curva di crescita di un ceppo veicolante un plasmide Il ceppo J53 è un E. coli in grado di ospitare un plasmide (es. R64) o altro simile ma di P.M. superiore. In ogni caso la semplice aggiunta di altro materiale genetico incide sulla velocità di crescita. D.O. Tempo 45

Ceppo selvaggio e suo derivato resistente alla rifaximina 46

Il ceppo resistente risulta subire gli stessi effetti del ceppo sensibile ma a concentrazione maggiore 47

Enterobatteri Costo biologico della resistenza Fitness batterica: concetto complesso da definire comprende molte componenti: Tasso di crescita (test COMPETIZIONE) Virulenza (test in vivo, espressione fattori di patogenicità) Il costo biologico della R lo deduciamo da un cambiamento nella fitness Misuriamo la fitness soprattutto tramite tasso di crescita e virulenza Efficienza nella trasmissione e capacità di persistere nell’ospite – virulenza 48 Andersson e Levin, Curr Opin Microbiol, 1999; Andersson Curr Opin Microbiol, 2006 48

Enterobatteri fosfomicino-R Costo biologico ceppi mutanti di E. coli e K. pneumoniae rispetto agli isogenici: hanno ridotta velocità di crescita sono più sensibili alla fagocitosi Modificata idrofobicità di superficie Li Pira, Pruzzo e Schito Eur. Urol, 1987 49

Conclusions Thus, reversibility studies at both the individual and community level indicate that often resistant bacteria are able to persist for a long time, even if no antibiotic selective pressure is present. Compensatory evolution, cost-free mutations and co-selection of resistance markers provide likely explanations for this poor reversibility. 50

Although the acquisition of resistance genes frequently comes at a cost to fitness, especially when a plasmid is transferred, antibiotic-resistant pathogens rapidly acquire compensatory mutations that restore their full competitive fitness and virulence (Fig 2).

First people say it isn’t true, E. Peter Greenberg, 1997, Quorum sensing in Gram-negative bacteria ASM News, 7:371-377 “It has been said that every novel idea in science passes through three stages. First people say it isn’t true, then they say it’s true but not important, and finally they say that it’s true and important, but not new.” A questo punto sarebbe facile dire che i NB (o CNP, comunque si vogliano chiamare) non esistono e sono un artefatto; ma è indubbio che le fotografie pubblicate da Kajander e Ciftioglu che ho mostrato all’inizio mostrano un batterio. Ricordo qui di un articolo che ho letto diverso tempo fa e che probabilmente è noto alla maggior parte dei presenti. E’ scritto da Greeberg che, raccontando delle difficoltà incontrate per far accettare alla comunità scientifica il modello del quorum sensing, dice: “…” Nel caso dei NB la situazione è stata un po’ diversa e fin dall’inizio l’idea di queste forme piccolissime, sebbene con molta riserva, è stata ben accolta dalla comunità scientifica, anche sostenuta da interessi commerciali. Pur cercando di mantenere una mentalità aperta e priva di pregiudizi, sono però convinta che l’esistenza e le proprietà di queste forme debbano essere studiate e caratterizzate rigorosamente e più rigorosamente di quanto fatto fino ad ora, seguendo un approccio scientifico, basato su prove sperimentali ripetute e confermate, sia in vitro che, poi, in vivo.