Oncologia Sperimentale di laboratorio IL PROCESSO METASTATICO 4° S. Beninati

Metastasi Per metàstasi si intende la disseminazione di un processo evolutivo dalla sua sede di origine ad altri organi dell'individuo. Le metastasi possono avere natura infettiva (dunque, metastasi settiche), ma più spesso con questo termine si indicano le metastasi tumorali: in questo caso, derivano dalla crescita di cellule tumorali individuabili da alcune caratteristiche tipiche del tessuto originario ma non del sito di impianto.

La capacità di dare metastasi è la principale peculiarità che hanno i tumori maligni rispetto ai tumori benigni, e sono quasi sempre proprio le metastasi quelle che provocano la morte dell'organismo, raramente il tumore primitivo. Ciò è dovuto anche al fatto che le metastasi sono formate da cellule molto più resistenti, aggressive ed efficienti di quelle presenti nel tumore primitivo.

La gran parte delle neoplasie maligne si accresce, invade i tessuti circostanti e si dissemina nell’organismo ospite dando origine ad altre formazioni neoplastiche, separate e distanti dal tumore primario. Questo processo è noto come metastatizzazione, e le formazioni neoplastiche secondarie sono dette metastasi .

Modalità di Diffusione Un tumore diffonde per diffusione continua o locale oppure per propagazione a distanza. Entrambe le modalità possono coesistere, ma la seconda implica la presenza di discontinuità fra la sede primitiva e i focolai secondari. Quindi le neoplasie metastatizzano allorquando alcune cellule neoplastiche abbandonano il sito di origine e si diffondono nell’organismo attraverso i canali preesistenti (vasi ematici e linfatici), gli spazi connettivali e le grandi cavità.

Disseminazione per via ematica La disseminazione per via ematica è caratteristica di molti sarcomi, di qualche carcinoma, del corioepitelioma e di tumori che insorgono in distretti privi di vasi linfatici. Per la crescita metastatica è fondamentale il contributo della rete vascolare formata da neoangiogenesi che circonda il tessuto neoplastico e si spinge al suo interno. le pareti di questa rete vascolare sono strutturate male (sono povere di periciti e di cellule muscolari lisce) e relativamente permeabili, rappresentando quindi un facile accesso al circolo ematico per cellule che rilasciano enzimi proteolitici (metalloproteasi) in grado di lisare la membrana basale periendoteliale.

Le pareti capillari, a differenza di quelle venose ed arteriose, non sono costituite da tre tonache concentriche, ma da un singolo strato di cellule endoteliali appiattite che poggia su una membrana basale; la parete capillare è quindi priva di fibre muscolari, elastiche e fibrose. Questa peculiarità morfologica ha lo scopo di facilitare lo scambio di sostanze con il liquido interstiziale. Molti capillari sono associati a cellule, dette periciti, che regolano la permeabilità dell'endotelio, opponendosi a tali passaggi; tanto maggiore è il numero di periciti e tanto minore è la permeabilità capillare.   endotelio

Migrazione transendoteliale Tumore secondario Tumore primario Ingresso nel circolo proliferazione Cellule metastatiche capillare neutrofili Migrazione transendoteliale Tumore secondario

Angiogenesi La formazione di nuovi vasi comporta l’attivazione di un processo proliferativo e differenziativo nelle cellule endoteliali dei capillari dell’ospite, dai quali originano gettoni cellulari solidi che successivamente si canalizzano e si strutturano in formazioni vasali più o meno regolari. Per l’innesco e il mantenimento di questo processo è necessario che una sottopopolazione delle cellule neoplastiche del tumore primitivo assuma il fenotipo angiogenico.

Angiogenesi Le cellule tumorali con questo fenotipo possono attivare la secrezione di uno o più fattori positivi, oppure mobilizzarli dalla matrice extracellulare o, anche, reclutare cellule dell’ospite (come ad esempio i macrofagi, i quali producono proprie proteine angiogeniche). I fattori angiogenici più comunemente presenti nei tumori sono il basic fibroblast growth factor (bFGF) e il vascular endotelial growth factor (VEGF).

Angiogenesi Dal punto di vista morfologico, la vascolarizzazione tumorale è composta da vasi di tipo capillare e precapillare che originano dalle venule dell’ospite. può assumere un aspetto periferico (vasi di maggior calibro che circondano il focolaio e che inviano capillari verso il centro della neoplasia), oppure un aspetto centrale (vaso centrale maggiore al centro del tumore con ramificazioni alla periferia). Una volta penetrate all’interno di un vaso ematico, le cellule neoplastiche circolano sotto forma di aggregati omotipici o eterotipici (emboli neoplastici) e vengono intrappolate nei principali distretti capillari, dove si arrestano, permeano gli endoteli e si riversano nei tessuti extravascolari dando luogo alla formazione di focolai metastatici.

Globuli rossi tumore sezione di un vaso sanguigno che irrora un melanoma

Sebbene alcune cellule neoplastiche possano invadere i tessuti passivamente, cioè attraverso un meccanismo di crescita ed espansione cellulare, il ruolo principale dell’invasione locale è giocato dalla motilità cellulare: alcune cellule tumorali secernono esse stesse fattori di motilità autocrini, ma in generale il movimento è stimolato da fattori esogeni paracrini solubili (chemiotattici) e insolubili (aptotattici).

Il numero delle cellule neoplastiche che si riversano nel torrente circolatorio è di gran lunga superiore a quello delle cellule in grado di formare focolai metastatici. La scarsa differenziazione (anaplasia) del tumore primario e la presenza di fenomeni necrotici al suo interno sono le caratteristiche che sembrano favorire maggiormente il passaggio in circolo di emboli neoplastici. In ogni caso l’indice di mortalità tra le cellule neoplastiche è molto elevato: di tutti gli elementi neoplastici che penetrano nel torrente circolatorio, meno dello 0,01% è in grado di dare luogo allo sviluppo di focolai metastatici.

Disseminazione per via linfatica La disseminazione per via linfatica è caratteristica dei carcinomi, molti dei quali sintetizzano e secernono fattori, come il VEGF-C e il VEGF-D, che promuovono la formazione di nuovi capillari (linfangiogenesi), o incrementano il diametro di quelli esistenti, interagendo con specifici recettori (VEGF-R3). Le cellule neoplastiche penetrano nei vasi linfatici, ove assumono un aspetto a cordoni solidi (permeazione) o ad aggregati cellulari (embolizzazione), con meccanismi identici a quelli adoperati per l’ingresso nel circolo ematico.

La diffusione sotto forma di emboli è la principale modalità di disseminazione dei tumori primari nei linfonodi regionali e, via via, lungo le altre stazioni linfatiche. Una volta che le cellule neoplastiche siano giunte nei linfonodi regionali possono verificarsi varie evenienze:

Linfonodi Sentinella

Disseminazione per via linfatica e/o ematica

Linfonodo regionale 1. esse proliferano e sostituiscono progressivamente le cellule linfoidi locali; il flusso della linfa efferente viene quindi circuitato o convogliato all’indietro trascinando con sé le cellule neoplastiche nate nel linfonodo, cellule che si vanno a depositare in stazioni linfatiche situate più a valle (il linfonodo regionale si comporta in pratica da sorgente di ulteriori metastasi, le metastasi secondarie)

2. le cellule neoplastiche muoiono in loco, o in seguito a qualche deficienza metabolica o per azione degli elementi immunocompetenti presenti nel linfonodo; 3. le cellule neoplastiche sopravvivono nel linfonodo, ma in uno stato di latenza, e non generano metastasi secondarie.

Capsula linfonodale La tendenza al superamento più o meno precoce della capsula linfonodale dipende essenzialmente dall’istotipo, ma quando l’adenopatia supera la dimensione di circa 5 cm la rottura capsulare con estrinsecazione delle cellule tumorali è praticamente costante per tutte le neoplasie. La funzione barriera dei linfonodi regionali è quindi parziale e può essere ulteriormente compromessa in seguito a procedimenti diagnostici (linfoangiografia) o terapeutici (irradiazione locale, trattamento con steroidi).

Disseminazione per contiguità La disseminazione per contiguità o per cavità non è inconsueta: i carcinomi dello stomaco, del colon e dell’ovaio possono metastatizzare in cavità peritoneale; i carcinomi della mammella, del polmone e dell’esofago diffondono nella cavità pleurica e/o pericardica; i tumori del plesso corioideo, gli ependimomi, i pinealomi e i medulloblastomi possono diffondere lungo la cavità cerebro-spinale, anche se la formazione di metastasi al di fuori del sistema nervoso centrale è di eccezionale riscontro.

Meccanismi del processo metastatico La composizione cellulare delle neoplasie maligne è eterogenea e soltanto alcune cellule tumorali sono in grado di formare metastasi. La comparsa di focolai metastatici è quindi il risultato di un drastico processo di selezione che interviene nelle varie tappe del processo di disseminazione neoplastica:

Fasi del processo metastatico invasività locale; passaggio nel circolo ematico o linfatico; arresto nel distretto capillare; permeazione degli endoteli; colonizzazione di tessuti eterotipici.

Fenotipo metastatico Le cellule che sono in grado di superare tutti i passaggi elencati hanno il fenotipo metastatico e costituiscono una sottopopolazione del tumore primitivo emergente accanto ad altre sottopopolazione di cellule incapaci di generare metastasi (fenotipo non metastatico). La comparsa del fenotipo metastatico è un caso particolare del processo di diversificazione prodotto dall’instabilità genetica

Infatti, malgrado l’origine monoclonale, ampiamente accettata per la maggioranza dei tumori e le loro metastasi, la popolazione neoplastica diviene notevolmente eterogenea a causa di un’intrinseca instabilità genetica delle sue cellule. Mentre fenotipicamente emergono le molteplici proprietà cellulari necessarie per produrre metastasi in molti tipi diversi di tumore, genotipicamente non sembra esservi un singolo gene specifico (gene metastatico) che regola tali proprietà in tutti i tumori.

In ogni caso è certo che il fenotipo metastatico è indipendente dal fenotipo tumorale e appare verosimile che il processo metastatico venga regolato mediante l’attivazione e/o la disattivazione di molti geni specifici. Si ritiene che ogni fase della cascata metastatica possa essere regolata da cambiamenti transitori o permanenti a livello del DNA o RNA in geni differenti, e differenti geni regolatori potrebbero essere coinvolti nei diversi tipi di tumori.

Il gene KiSS-1 Un gene umano anti-metastatico, il KiSS-1, è stato recentemente localizzato nella regione cromosomica 1q32-41. Esso codifica per una proteina, presumibilmente coinvolta nella trasmissione di segnali di membrana e/o nell’organizzazione delle strutture citoscheletriche, che è presente nei melanociti normali e nelle cellule di melanomi a basso potenziale metastatico ed è invece assente nelle cellule melanomiche invasive e metastatizzanti.

Meccanismi di difesa dell'ospite Le cellule tumorali, una volta penetrate nel circolo sanguigno, ricevono un attacco da parte del sistema immunitario dell’ospite: infatti solo un piccolissima parte delle cellule tumorali sopravvive ed è in grado poi di creare tumori secondari. I possibili meccanismi di morte cellulare includono: stress meccanici in vasi sanguigni di piccolo calibro, cattiva nutrizione, tossicità dovuta agli elevati livelli di ossigeno nel sangue, azione di cellule effettrici immunitarie specifiche o aspecifiche come linfociti T, polimorfonucleati, macrofagi o cellule natural killer (NK), le quali sembrano essere molto efficaci contro le cellule tumorali veicolate dal sangue mentre mostrano un effetto limitato contro cellule tumorali che hanno già formato piccoli focolai metastatici.

Migrazione e crescita Una volta uscite dal torrente ematico, le cellule neoplastiche isolate evidenziano un fenomeno migratorio intraparenchimale che le porta ad addossarsi al sistema arterioso dell’ospite. La successiva evoluzione proliferativa interessa una minoranza delle cellule migrate, molte delle quali rimangono isolate.

È verosimile che una quota di queste ultime sia destinata a morire e che altre restino quiescenti per periodi di tempo indeterminati. Le cellule neoplastiche che proliferano danno luogo a localizzazioni microscopiche che si dispongono a guisa di manicotto intorno ai vasi o di sottile superficie tra i vasi contigui vicini. La maggior parte di tali formazioni, in assenza di fenomeni angiogenici, raggiunge presto una dimensione limite di qualche centinaio di micron e cessa di crescere volumetricamente

Linfonodi neoplasia con diametro massimo maggiore di 3 cm linfonodi neoplasia con diametro massimo inferiore a 3 cm regione peribronchiale

psg5 (TG-overexpression) Control

Copyrigth “Lab. Biochim. Cell.” Univ. Tor Vergata

Copyrigth “Lab. Biochim. Cell.” Univ. Tor Vergata

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quiescenza clinica Un’analisi cinetica di queste micrometastasi avascolari mette in evidenza la presenza di un equilibrio dinamico in cui proliferazione e morte cellulare per apoptosi sono equivalenti. Questo stato micrometastatico può essere considerato di “quiescenza clinica”, essendo le dimensioni interessate decisamente al di sotto di quelle clinicamente significative.

Fattori di crescita La proliferazione delle singole cellule insediate nell’organo bersaglio avviene in risposta a fattori di crescita paracrini che possono essere espressi in modo differente nei vari organi. Epidermal growth factor (EGF), IGF, growth factor \beta (TGF-\beta) sono alcuni dei fattori identificati. Vi sono anche elementi che suggeriscono l’ipotesi che alcune neoplasie, soprattutto quelle con maggior capacità metastatizzante, posseggano meccanismi autocrini di sostegno della crescita.

neovascolarizzazione. Una piccola percentuale delle micrometastasi ,in cui evidentemente vi sono cellule che esprimono il fenotipo angiogenico, mostra il fenomeno della neovascolarizzazione. Nel momento in cui nuovi vasi vengono creati dalla proliferazione delle cellule endoteliali a partire dai vasi dell’ospite, si registra una drastica riduzione della apoptosi mentre la proliferazione prosegue a livelli pressoché invariati, e la metastasi inizia a crescere per espansione della popolazione neoplastica e di quella endoteliale associata.

Solo queste ultime metastasi raggiungono un livello dimensionale clinicamente significativo. La selettività per specifiche sedi vascolari è legata: ai meccanismi di adesione alle pareti vasali, al tipo di enzimi degradativi prodotti dalla cellula neoplastica e di enzimi inibitori presenti nel tessuto invaso, ai fattori chemiotattici e aptotattici che guidano l’insediamento della singola cellula nei siti ottimali per la proliferazione, ai fattori di crescita autocrini e paracrini e alla possibilità di iniziare e mantenere il processo angiogenico.

Localizzazione delle metastasi Nel 1889 Paget formulò l’ipotesi del “terreno e seme”, in cui egli postulò che possono verificarsi interazioni differenziali cellula tumorale- organismo ospite, con aspetti più o meno favorevoli allo sviluppo metastatico. Un’ipotesi alternativa è che la cosiddetta “organo-preferenza” si possa spiegare sulla base di considerazioni emodinamiche : il numero di metastasi che si sviluppano in un organo è relativo al numero di cellule rilasciato all’organo dal flusso ematico ed al numero di cellule che si arrestano nei capillari.

Organi bersaglio Quindi per i tumori la cui rete vascolare drena nel circolo venoso sistemico, l’organo di primo passaggio dovrebbe essere il polmone; mentre per i tumori il cui drenaggio venoso avviene nel sistema portale (tumori gastrointestinali), questo dovrebbe essere il fegato.

Sistema Portale La vena Porta raccoglie circa l’80% del sangue proveniente dagli organi addominali e lo conduce al fegato, dove ne vengono estratte delle sostanze dannose Successivamente, il sangue così “ripulito”, viene riversato nella circolazione sistemica attraverso la vena cava.

In ogni caso le metastasi, generalmente, compaiono a livello dei linfonodi regionali o degli organi il cui letto capillare è il filtro dei principali sistemi venosi: il polmone per il sistema delle cave, il fegato per quello portale. Alcune neoplasie, a causa della loro sede anatomica, metastatizzano di preferenza in determinati distretti. Il carcinoma polmonare, ad esempio, forma frequentemente metastasi cerebrali poiché le sue cellule invadono le vene polmonari, raggiungendo il ventricolo sinistro e penetrano poi nelle arterie carotidi; i carcinomi della mammella, invece metastatizzano frequentemente in corrispondenza delle vertebre raggiunte attraverso il plesso o sistema venoso di Batson

L’organotropismo selettivo di alcune cellule metastatiche potrebbe anche essere dovuto alla proprietà di queste cellule di sopravvivere e di moltiplicarsi esclusivamente o preferenzialmente in un dato distretto anatomico. Lo sviluppo di un focolaio metastatico richiede la formazione di uno stroma di supporto, che deve essere necessariamente costruito a spese della matrice extracellulare dell’organo sede della colonizzazione neoplastica. La composizione di questa matrice varia da tessuto a tessuto: il polmone è ricco di collageno di tipo IV, laminina ed elastina; il fegato di eparan solfato; l’encefalo di mielina e di glicoproteine mielina-associate.

È quindi possibile che la selettività d’impianto delle metastasi di alcune neoplasie umane in determinati organi sia in parte condizionata dal tipo di enzimi idrolitici che la cellula metastatica è in grado di sintetizzare e rilasciare nel mezzo esterno, e dal tipo di molecole che la matrice interstiziale esprime: se capaci o meno di fungere da ligandi per le integrine neoplastiche promuovendo (nel primo caso) o impedendo (nel secondo) la sopravvivenza delle cellule metastatiche.

Studio del processo metastatico in vitro

Metastasi sperimentali E’ possibile riprodurre parte del processo metastatico in vitro. In particolare l’adesione e la migrazione possono essere studiate per mezzo di apparati che mimano il processo stesso. La procedura utilizza le cosidette ”Camere di Boyden”

Camere di Boyden La camera di Boyden è un contenitore di pexiglass diviso in due scompartimenti da un filtro con pori di sezione nota. La parte superiore agisce da contenitore del mezzo di coltura contenente le cellule tumorali da saggiare. La parte inferiore mima l’organo bersaglio e in genere contiene un estratto di questo

CAMERA DI BOYDEN Mezzo di colture con cellule tumorali Matrigel filtro Estratto d’organo

MATRIGEL Il filtro poroso è ricoperto da una miscela di proteine contenute in un gel e mima la membrana basale. Tale gel è denominato Matrigel Le cellule tumorali producono metalloproteasi che proteolizzano il matrigel attraversando il filtro e disponendosi nella parte inferiore di esso.

COMPONENTI DEL MATRIGEL Laminina 56 % Collagene IV 31 % Entactina 8 % fattori di crescita 5 %

Analisi del filtro Dopo l’esperimento di metastasi, i filtri sono rimossi e lavati per allontanare le cellule non adese. I filtri sono quindi analizzati al MO e le cellule adese nella parte inferiore contate con un analizzatore d’immagine computerizzato. Tanto più alto sarà il numero di cellule che hanno attraversato il filtro tanto più alto sarà il potere metastatico delle celule esaminate

Control 72hr 48h

Dal numero di cellule del controllo (non trattato con antineoplastico) e delle cellule trattate si costruisce un grafico dal quale si può evincere se il farmaco possiede attività antimetastatica % invasion Riduzione del 30% Riduzione del 50%