DETERMINAZIONE DI POLICLOROBIFENILI IN MATRICI ANIMALI MEDIANTE ANALISI GC E GC-MS Menotta* S., Fedrizzi* G., Ferretti** E. * Laboratorio Chimico Merceologico IZSLE- CCIAA Bologna. ** IZSLE- Brescia L'abbinamento dell'analisi GC con la GC-MS permette di individuare e di confermare la presenza dei policlorobifenili in esame. La sensibilità di un rivelatore di massa (SCAN) può essere anche 100 volte inferiore rispetto a quella di un detector a cattura elettronica, ma effettuando l'analisi monitorando per ogni analita un singolo ione molecolare (SIM) la sensibilità viene notevolmente elevata e può essere superiore all'ECD. PROCEDIMENTO DI ESTRAZIONE RIASSUNTO In questo lavoro viene proposto un metodo per la determinazione quali-quantitativa di policlorobifenili (PCB) in prodotti di origine animale. Il metodo prevede l'estrazione della frazione lipidica dalla matrice seguita da un’idrolisi e da una doppia purificazione (Extrelut® e cromatografia ad esclusione molecolare); l'analisi strumentale condotta sull’estratto finale prevede un abbinamento GC-ECD e GC-MS. Il limite di rilevazione (LOD) del metodo è di 2 ng/g di grasso e quello di quantificazione (LOQ) è di 3 ng/g di grasso. PAROLE CHIAVE: Policlorobifenili, GC-ECD, GC-MS, GPC. Tessuto adiposo (30 g) Evaporazione solvente (Rotavapor 55°C) Attivazione Extrelut® A 100° per una notte Estrazione sodio solfato anidro + 150 mL Acetone- Esano (Ultrasuoni) -Filtrazione su carta in palloni da 250 mL -Acido Solforico (15 mL) Caricamento del Campione di grasso (5g in 25 mL di esano) Concentrazione e analisi GPC Eliminazione del solvente (Corrente d’azoto) Recupero campione 200 µL Toluene GC-ECD GC-MS -Percolazione -Eluizione (5 volte con 25 mL di esano) INTRODUZIONE I policlorobifenili (PCB) sono molecole chimiche di sintesi ottenute per clorurazione diretta del bifenile. Dalla reazione si possono ottenere 209 congeneri diversi per grado di clorurazione e per posizione degli atomi di cloro. Si distinguono per la loro stabilità e resistenza agli acidi, alle basi, agli ossidanti e ai riducenti. Per le loro caratteristiche lipofile e le proprietà ignifughe ed isolanti hanno trovato un larghissimo uso come fluidi industriali, idraulici, ritardanti delle fiamme e fluidi dielettrici per condensatori e trasformatori. La loro tossicità si esplica in maniera diversa a seconda del numero e della posizione degli atomi di cloro presenti. Si manifesta con lesioni cutanee e oculari e con danni epatici e polmonari. Alcuni metaboliti presentano attività mutagena e cancerogena. Il recente problema di contaminazione da diossina e da PCB degli alimenti provenienti dal Belgio ha riacutizzato il problema della loro determinazione negli alimenti carnei. La loro determinazione analitica d’altro canto, risulta essere più semplice dell’analisi delle diossine richiedendo strumentazioni e procedure meno complesse. In questa emergenza il problema analitico riguarda principalmente la determinazione quali-quantitativa dei 7 congeneri (PCB 28, 52, 101, 118, 153, 138, 180) quali indicatori generici di contaminazione. Data la loro lipofilia, la determinazione dei policlorobifenili viene effettuata sulla frazione lipidica. L’estrazione del grasso può essere effettuata con diverse tecniche come l’estrazione solido-liquido, con solvente apolare mediante estrazione con Soxhlet o con fluidi supercritici. La purificazione presenta numerosi problemi a causa degli interferenti presenti ed è possibile procedere con idrolisi acida o basica della frazione lipidica e successiva estrazione in fase solida su colonnine Florisil, di silice, C18 o allumina o con una sequenza di due colonnine. La rilevazione finale è in tutti i casi effettuata in GC con ECD e in alcuni casi mediante GC-MS. MATERIALI E METODI REAGENTI Sodio solfato anidro, n-esano, diclorometano e acido solforico 96%, acetone, etere di petrolio iso-ottano, cicloesano, toluene. Colonne Extrelut 20 NT, colonnine Florisil (1g). Standard di PCB (Dr.Erhestonfer) e o-p-DDE (Riedel de Haen) come standard interno. IUPAC # Struttura 28 2,4,4’-triclorobifenile 52 2,2’,5,5’-tetraclorobifenile 101 2,2’,4,5,5’-pentaclorobifenile 118 2,3’,4,4’,5-pentaclorobifenile 153 2,2’,4,4’,5,5’-esaclorobifenile 138 2,2’,3,4,4’,5’-esaclorobifenile 180 2,2’,3,4,4’,5,5’-eptaclorobifenile STRUMENTAZIONE Stufa, Soxtec System Extraction Unitt, bagno ad ultrasuoni Apparecchiatura per la cromatografia ad esclusione molecolare (GPC) (LabService Analitica) con colonna in vetro 50x3 cm ID, impaccata con una resina SX3 in Stirene-Divinilbenzene 200-400 mesh (LabService Analitica). Gascromatografo HP 5890 con EPC dotato di iniettore split-splitless e rivelatore a cattura elettronica (ECD). Colonna HP 5 trace analysis (30 m, ID 0,25 mm, film 0,25 µm (Hewlett Packard). Gascromatografo HP 5890 con EPC dotato di iniettore split-splitless e di rivelatore a spettrometria di massa a quadrupolo tipo 5972A con colonna HP 5 MS (30 m, ID 0,25 mm, film 0,25 µm). TABELLA 3: Recuperi degli standard di PCB ottenuti con 4 diverse metodologie di purificazione CONCLUSIONI Il metodo proposto permette un'analisi della miscela di policlorobifenili presenti in matrici di origine animale con un limite di quantificazione pari a 3 ng/g di grasso per ogni PCB analizzato: Il metodo permette una notevole automazione in quanto la purificazione viene effettuata da un GPC che a differenza di una SPE non richiede la presenza costante di un operatore. L'abbinamento fra GC-ECD e GC-MS inoltre permette la determinazione quali-quantitativa inequivocabile dell'analita presente. D'altra parte però i tempi di analisi previsti sono piuttosto lunghi e richiedono quantitativi di solventi piuttosto elevati. TABELLA 2: Fattori di risposta dei PCB nei confronti dello standard interno. (o-p-DDE) RISULTATI E DISCUSSIONE I parametri di linearità di risposta in GC-ECD per ogni PCB e del DDE analizzati sono riportati in Tabella 1. Per ciascun PCB sono stati iniettati 1, 0,75, 0,5, 0,25, 0,1, 0,01 ng. L'elaborazione delle curve è stata effettuata con il metodo dei minimi quadrati secondo l'equazione y=mx+q. Il limite di rilevazione del detector a cattura elettronica è di 0,0005 ng di PCB. Per tutti i PCB considerati è stato calcolato il Fattore di Risposta (RRF) nei confronti dello standard interno (DDE). In Tabella 2 sono riportati i valori. Nel presente lavoro sono stati testati 4 diversi singoli passaggi di purificazione: GPC, colonnina di Florisil, colonna di Extrelut e dibattimento con acido solforico concentrato. In Tabella 3 sono riportati i recuperi percentuali delle 4 metodologie a confronto; la purificazione con GPC e su colonnina di Florisil presentano i recuperi e i CV migliori. I recuperi medi della GPC dopo l'ottimizzazione della miscela di eluizione, erano compresi fra il 65,38% del PCB 28 e il 94,31% del PCB 118. Al fine di ottenere dei tracciati cromatografici puliti sono state testate 3 metodologie di purificazione che prevedevano l'abbinamento di 2 diversi procedimenti di purificazione da adottare in sequenza. 1. purificazione del grasso su Florisil con successivo dibattimento in acido solforico, 2. idrolisi del grasso su Extrelut e la successiva purificazione su Florisil 3. idrolisi del grasso su Extrelut e la successiva purificazione con GPC In Tabella 4 sono riportati i recuperi percentuali e i CV per i diversi congeneri. L'abbinamento dell'idrolisi acida su Etrelut con la cromatografia ad esclusione molecolare (GPC) determina effettivamente una buona separazione della frazione contenente i PCB e quindi un estratto pulito. L'idrolisi effettuata prima della purificazione consente l'utilizzo di quantità di campione di partenza piuttosto elevate (5g) quindi una maggiore rappresentatività e riproducibilità delle analisi. Inoltre l'idrolisi acida direttamente su colonna evita in gran parte la degradazione dei PCB. Questa reazione indesiderata infatti si verifica frequentemente quando si effettua un'idrolisi acida o alcalina violenta mediante dibattimento del campione (vedi Tabella 3). Il limite di rilevazione del metodo è di 2 ng/g di grasso mentre quello di quantificazione è di 3 ng/g di grasso. TABELLA 4: Recupero % dei 7 congeneri di PCB da matrici fortificate con 10 ng/g di ciascun analita. TABELLA 5: Elenco degli ioni monitorati per ogni singolo PCB BIBLIOGRAFIA 1)Safe S., Safe L., Mullin M.: "Polychlorinated Biphenyls: Congener-Specific Analysis of a Commercial Mixture and a Human Milk Extract" J. Agric. Food Chem. 1985, 33, 24-29. 2) Gazzetta Ufficiale delle comunità europee n° 1999/363/CE del 3/6/99. 3) Gazzetta Ufficiale delle comunità europee n° 1999/390/CE del 11/6/99. 4) "Linee guida per interventi analitici mirati al rilevamento di PCB, PCDD e PCDF in prodotti alimentari" Rif. ISS-XEN-99-4 Versione 1 Luglio 1999. 5) Larsen B.R.:"HRGC separation of PCB congeners", J. High Resol. Chromatogr., 1995, 18, 141-151. Shenck F.J., Wagner R., Henness M.K. and Okrasinski L.Jr.: "Screening of organochlorine Pesticide and Polychlorinated Biphenyl residues in nonfatty seafood products by tandem solid-phase extraction cleanup", J.of AOAC Int. 1994, 77, 102. TABELLA 1: Parametri delle rette di calibrazione dei 7 congeneri di PCB analizzati.