Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Corso di laurea triennale in Scienze Biologiche Curriculum Biosanitario Uso delle cellule staminali embrionali come strategia terapeutica per il trapianto renale e la limitazione (risoluzione) del rigetto d'organo Candidato Relatore Daniela De Rosa Loretta Tuosto 2014/2015

Fisiologia e funzione renale Il nefrone è l’unità funzionale del rene GLOMERULO: Rete densa di capillari che filtrano il sangue. CAPSULA DI BOWMAN: Cattura il fluido che è stato filtrato fuori dalla circolazione sanguigna e lo trasferisce nei tubuli. TUBULO: Circondato da un singolo strato di cellule specializzate il cui compito è riassorbire acqua ed elettroliti nel sangue FUNZIONE OMEOSTATICA FUNZIONE ESCRETIVA FUNZIONE ENDOCRINA

CLASSIFICAZIONE DEI TRAPIANTI Il trapianto renale CLASSIFICAZIONE DEI TRAPIANTI Trapianto ortotopico Trapianto eterotopico Autotrapianto Isotrapianto Allotrapianto Xenotrapianto

Compatibilità dei tessuti ANTIGENI ABO ANTIGENI HLA I classe HLA-A, HLA-B, HLA-C II classe HLA-DR, -DP-, DQ CLASSE I: espresse sulla superficie di tutte le cellule nucleate, fisiologicamente deputate alla presentazione di peptidi antigenici ai linfociti T citotossici CD8+. CLASSE II: espresse sulla membrana di APC (cellule dendritiche, macrofagi, cellule B). Le APC sono fisiologicamente deputate alla presentazione di peptidi antigenici ai linfociti T helper CD4+.

Alloriconoscimento a) DIRETTA: I linfociti T del ricevente riconoscono l’MHC intatto del donatore come estraneo. b) INDIRETTA: I frammenti peptidici delle molecole MHC del donatore presentati da MHC II dell’ospite sono riconosciuti come estranei.

Il rigetto d’organo RIGETTO IPERACUTO RIGETTO ACUTO RIGETTO CRONICO

Prevenzione e trattamento del rigetto RIDUZIONE DELL’IMMUNOGENICITA’ Tipizzazione tissutale HLA Tipizzazione del gruppo sanguigno ABO Screening per la presenza di anticorpi preformati Reazione mista linfocitaria IMMUNOSOPPRESSIONE Ciclosporina Tacrolimus Azatiopirina Farmaci antiinfiammatori (corticosteroidi) INDUZIONE DI TOLLERANZA Anergia clonale Apoptosi indotta Sviluppo di linfociti T soppressori / regolatori

Cellule staminali La possibilità di generare organi e tessuti da sostituire a quelli malati a partire da cellule staminali proprie del paziente rappresenta uno dei più recenti obiettivi della medicina rigenerativa. INDIFFERENZIATE CAPACI DI AUTO RIGENERARSI (self-renewal) CAPACI DI DIFFERENZIARSI IN TIPI CELLULARI SPECIFICI CAPACI DI RIPOPOLARE UN TESSUTO in vivo A - le cellule staminali; B - cellule progenitrici; C - cellula differenziata; 1 - divisione simmetrica delle cellule staminali; 2 - divisione asimmetrica delle cellule staminali; 3 - divisione progenitore; 4 - terminale di differenziazione

Classificazione delle staminali

Cellule staminali embrionali VANTAGGI Originano cellule provenienti da tutti e tre i foglietti embrionali. Crescita in vitro senza cambiarne fenotipo o cariotipo le rende promettenti per la rigenerazione e per la riparazione dei tessuti. Ridotta immunogenicità, piccole quantità di molecole HLA I e nessuna molecola HLA II. SVANTAGGI Evoluzione in teratomi. ICM Oct4, Foxd3 Pluripotenza ECTODERMA (tes.nervoso, epiteli e ghiandole, capelli, unghie , cristallino) ENDODERMA (app.digerente, respiratorio, tiroide, paratiroide) MESODERMA (t.osseo, t.muscolare, cuore, vasi ,t. connettivo, pleure, peritoneo, sistema urogenitale)

Il rene è un organo di origine mesodermica Sviluppo del rene Il rene è un organo di origine mesodermica Il MM specificato da Hoxa11, Hoxc11, Hoxd1 , Wt1, per mezzo del rilascio di GDNF promuove l’evaginazione della gemma ureterica, che attraverso FGF2 e BMP7, promuove l’addensamento delle cellule mesenchimali attorno ad essa. GDNF, TGFβ1, BMP4, collagene VIII permettono la ramificazione dell’epitelio Foxb2 permette l’ddensamento pretubulare e il differenziamento in nefroni. Le cellule del cappuccio convertono la vitamina A in acido retinoico per mantenere l’espressione di Ret (recettore GDNF) nella gemma ureterica.

Un rene dalle staminali M. Takasato, H. Little et al, mostrano un protocollo che riesce a far differenziare le cellule staminali embrionali umane in tutte quelle necessarie a formare un "mini-organo renale”. Agonista della segnalazione Wnt canonica CHIR99021 Conc.elevate di BMP4/ATTIVINA a I FASE MESODERMA IM Hesc ENDODERMA STRISCIA PRIMITIVA Reporter “Green Fluorescent Protein” MIXL1 (segnalatore forte della striscia primitiva)

Livelli di espressione comparativa relativi a SOX17, Brachiury T, e MIXL1 al 3 gg per proporzioni di BMP4/Attivina A e CHIR99021 Analisi di classificazione delle cellule attivate da fluorescenza mostra più del 90 % di cellule GFP -MIXL1+ indotte con alte conc. di BMP4 su basse conc. di attivina A e con alte conc. di CHIR99021.

STRISCIA PRIMITIVA MESODERMA PM II FASE LPM STRISCIA PRIMITIVA MESODERMA PM IM La prima struttura a formarsi è il dotto nefrico lungo il quale appaiono tre paia di organi escretori: PRONEFRO, MESONEFRO, METANEFRO. FGF FGF9 FGF9 GDNF Wnt MM GERMOGLIO URETERICO EU NEFRONE

Co-localizzazione di PAX2 e LHX1 INDUZIONE BMP/ATTIVINA A AGONISTA Wnt CHIR99021 +FGF9

BMP4/ Attivina A + FGF9 + RA + BMP7 Inducono espressione transiente SIX2 e nessuna prova mesenchimale di PAX2. MIXL1, LHX1 SP OSR1, PAX2, LHX1 IM SIX2, WT1, GDNF, HOXD11 MM PAX2, CRET, HOXB7 EU

Agonista della segnalazione canonica Wnt (CHIR99021) e FGF9 inducono espressione prolungata SIX2 nel MM , espressione PAX2 nel MM e nell’EU. MIXL1, LHX1 SP OSR1, PAX2, LHX1 IM SIX2, WT1, GDNF, HOXD11 MM GATA3 co-espresso con EU PAX2+

Prove per l’induzione del nefrone dopo differenziazione CHIR99021 + FGF9 diretta. JAG1 CDH6 Primi nefroni/ vescicole renali

circondava l’EU (ECAD ⁺) JAG1 ⁺, ECAD⁺ vescicole renali Integrazione ed auto-organizzazione di cellule derivate da hESC indotte con protocollo CHIR99021 e FGF9. ECAD⁺, PAX2, AQP2 EU AQP1, SLC3A1, WT1, PAX2⁺ TP circondava l’EU (ECAD ⁺) JAG1 ⁺, ECAD⁺ vescicole renali

Lo studio dei ricercatori M. Takasato, H. Little et al Lo studio dei ricercatori M. Takasato, H. Little et al., mostra per la prima volta l’utilizzo di FGF9, dimostratosi cruciale per la sopravvivenza e lo sviluppo in continuo del MM. La creazione di un rene tramite l’uso di cellule staminali rende risolutivi (ed in ogni caso limitativi) i problemi connessi ai trapianti d’organo. RIGETTO D’ORGANO LISTE D’ATTESA DURATA LIMITATA USO DI IMMUNOSOPRESSIVI MANCANZA D’ORGANI