Lezione V-VI 11 Novembre 2009 corso di laurea specialistica magistrale Biotecnologia aula 6 martedì ore giovedì ore corso di genomica a.a. 2010/11

questa genomica da dove si è detto di partire? tutto il mondo è paese, la terra è tonda e anche la biologia considerando la circolarità ogni punto va bene consuntivo, riepilogo, banalizzazione: i genomi si possono usare a nostro comodo tanto derivano uno dall’altro la scelta dei vari organismi dipende dall’uso che se ne vuol fare

per avere mutanti si prendono i polimorfismi disponibili o si inducono mutazioni o si costruiscono organismi transgenici o si creano costrutti da studiare in cellule coltivate in vitro o si lavora in vitro su supporti artificiali sempre per osservare differenze “fenotipiche” ossia differenze di funzionamento

il genoma non trascritto e tradotto qualcuno ha inventato anche la parola metaboloma una per tutte, queste parole del paroloma vorrebbero indicare lo studio di quell’argomento in maniera globale vada per genomica che deriva da genoma, parola già usata vogliamo capire come un genoma intero si comporta e quali strutture usa durante il ciclo vitale dell’organismo cioè durante tutti i cambiamenti ambientali a cui è sottoposto

ripetizione del dramma del genoma dramma in quanto subisce sollecitazioni drammatiche: è fatto per funzionare; non può mai stare calmo, fermo e tranquillo ritorniamo allo zigote, 1) si fondono i due genomi dei gameti che per maturare da diploidi sono diventati aploidi icromosomi si condensano e decondansano, gli istoni subiscono n+1 trasformazioni, scivolano e si staccano, il Dna si metila e demetila, si svolge o superavvolge, tutto questo interagendo con proteina nucleihe, matrice e se stesso, compartimentazione, riarrangiamenti somatici

la dinamicità il genoma è vecchio ma gagliardo come vi ho detto è previsto tutto anche che si rompa, che ricombini, restando alle funzioni enzimatiche si possono ancora individuare e mappare nel genoma individuando nei genomi più complessi i geni ortologhi ed eventualmente parologhi individuati negli organismi modello più semplici il lievito ha fatto capire il funzionamento di molti onco-geni e geni dell’apoptosi, della trasduzione del segnale e ciclo cellulare e tanti altri

invece le regioni non codificanti come si trovano? questo è il gioco più interessante! potete sbizzarrire tutta la vostra fantasia quante funzioni vi vengono in mente? provate ad elencarle! proviamo a scavare! secondo me sono tante.

fenotipo / mutanti /polimorfismi analisi dei fenotipi (organismi polimorfici dall’ambiente) produzione e analisi dei mutanti (per supplire ai fenotipi degli organismi di laboratorio) sempre un fenotipo si analizza quante variabili sono presenti quanti approcci si possono utilizzare: si può iniziare dai vari punti, in silicio, in vitro, in vivo

analizzare le interazioni se un sistema è dinamico non se ne può prescindere analisi causa - effetto dall’analisi descrittiva dei fenomeni all’interpretazione dei meccanismi vogliamo vedere come è fatto, come cambia ed interagisce

il metodo di analisi cambia si inventano gli approcci diversi utilizzando le tecniche diverse sempre per approcci di tipo globale in silicio dalle banche dati in vitro con metodi di screening in vivo con campionamenti comunque i metodi partono dai confronti

esempio topo / uomo due genomi conosciuti mutanti umani spontanei polimorfismi già esistenti mutanti di topo indotti studi per differenza di fenotipi (espressione ed analisi ai diversi livelli con metodi di indagine diversa)

modello umano mutanti a disposizione: genetica di popolazione analisi di linkage approccio globale: analisi genomica globale “wide genome screening” in che consiste come è possibile” applicazione di tecniche diverse per lo screening punto di partenza: conoscenza dei polimorfismi

polimorfismi = mutazioni fissate mappaggio dei polimorfismi analisi dei polimorfismi con stessi strumenti e tecniche polimorfismi più comuni: SNPs e VNTR come si possono pescare nel genoma: - PCR e digestione del sito polimorfico - primer extension (solo su sequenza + e non -) - appaiamento dell’oligo e PCR - PCR e ibridazione su chips - PCR e resequencing dalle tecniche iniziali a queste genomiche

PCR e digestione del sito polimorfico 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’HpaI * +/- HpaI GTT’AAC n 600 bp 400 bp 200 bp

rilevazione per elettroforesi SM SM= size marker sample 1sample 2sample bp 400 bp 200 bp HpaI -HpaI +HpaI +/- omozigoti eterozigote

primer extension - appaiamento dell’oligo e PCR effetto simile con tecniche diverse estensione / non estensione (polimerasi normale, Klenow) amplificazione / non amplificazione (PCR)

PCR su piastra o ibridazione su chips metodo globale con maggior output dipende dal numero di PCR possibili su piastra e multiplex analisi di singoli genomi per molti siti polimorfici: analisi di amplificazione su piastra per fluorescenza tipo real time analisi per ibridazione su chips con le sequenze genomiche polimorfiche preamplificate

PCR e resequencing amplificazione dei frammenti da sequenziare per i siti polimorfici sequenziamento con metodo classico Sanger sequenziamento con ibridazione su microchips con oligos polimorfici (fluorescenza) sequenziamento shot-gun degli interi prodotti tramite chips ed oligos-adapters legati a palline (micro-beads) aggiunte successive di nucleotidi fluorescenti

produzione di mutanti processo analogo produzione di mutanti per ottenere fenotipi nuovi dacellule in coltura o da cellule staminali per ottenere topi transgenici metodo di mutagenesi esempio: ENU ethyl-nitroso urea ottenuti i topi inizia lo screening dei fenotipi di interesse analisi di genomica funzionale “delle interazioni”

quale punto di arrivo in questi approcci si risale dai fenotipi ai genotipi ricerca dei genotipi corrispondenti tramite dei marcatori o con confronti dei marcatori

i confronti con i polimorfismi mutanti e fenotipi dal lievito all’uomo sapendo che funzione andare a cercare o che metodo analitico si adotta si può immaginare il modello sperimentale esempio semplice: vedere i siti di metilazione che variano alle varie condizioni dalle regioni con maggior attività si inferisce se esistono clusters e conoscendo il genoma a cosa corrispondono un esempio di un approccio globale su lievito

un esempio di lievito Replication and active demethylation represent partially overlapping mechanisms for erasure of H3K4me3 in budding yeast. Radman-Livaja M, Liu CL, Friedman N, Schreiber SL, Rando OJ. PLoS Genet Feb 5;6(2) Abstract (il PDF è sul sito web con tutte le figure) Histone modifications affect DNA-templated processes ranging from transcription to genomic replication. In this study, we examine the cell cycle dynamics of the trimethylated form of histone H3 lysine 4 (H3K4me3), a mark of active chromatin that is viewed as "long-lived" and that is involved in memory during cell state inheritance in metazoans. We synchronized yeast using two different protocols, then followed H3K4me3 patterns as yeast passed through subsequent cell cycles. While most H3K4me3 patterns were conserved from one generation to the next, we found that methylation patterns induced by alpha factor or high temperature were erased within one cell cycle, during S phase. Early-replicating regions were erased before late-replicating regions, implicating replication in H3K4me3 loss. However, nearly complete H3K4me3 erasure occurred at the majority of loci even when replication was prevented, suggesting that most erasure results from an active process. Indeed, deletion of the demethylase Jhd2 slowed erasure at most loci. Together, these results indicate overlapping roles for passive dilution and active enzymatic demethylation in erasing ancestral histone methylation states in yeast.

yeast genomic methylation screening

fig 2 yeast methylation clusterizzazione dell’effetto Clustering of CCTS and CCA H3K4me3 patterns. Microarray measurements of H3K4me3 for each nucleosome was centered to zero for each time course to emphasize relative variation in methylation levels, and concatenated data for both time courses was subject to k-means clustering with k = 6.

fig 3 yeast histone methyl Nucleosomes methylated during cell cycle arrest lose H3K4me3 during the first S phase after release.

fig 6 yeast histone methylation Replication is not required for loss of H3K4 methylation

fenotipi mutanti e polimorfismi* dove si guarda (reg coding e non coding) cercando le funzioni genomiche creazione di esche per trovare con cosa interagiscono riprova in vivo con l’organismo transgenico per una conferma guardando la variabilità strutture variabili dalla variabilità e da come variano* si può inferire l’importanza della struttura e dopo in cosa consiste la struttura e forse la funzione strutture invariabili

fare i confronti il caso precedente è un esmpio interessante di approccio globale: si fanno i confronti multipli di tutti i siti o markers montati sul chip di cui si fa lo screening per la metilazione dell’istone (con immunoprecipitazione) e l’occupazione dei nucleosomi (per amplificazione) l’ibridazione dei microarrays avviene con sonde ad RNA si confrontano le regioni che ibridano o no a seconda se sono occupate o meno oppure che si amplificano o meno

approccio diverso da uno screening con two hybrid systems ricerca del fenomeno da riprodurre in vitro verificare se lo stesso costrutto interagisce con le stesse proteine tentativi non sempre di successo con two hybrid systems le tecniche hanno delle approssimazioni esca e oggetto interagente dall’approcio riduzionistico all’approccio olistico (non sempre si riesce ad avere un approccio globale con una tecnica nata per essere riduzionistica) strutture miste: interazioni DNA-proteine

il doppio ibrido è un esempio possibile (con molti falsi positivi) come spesso negli screening ricerca con un’esca dei fattori che la legano (di solito fattori di trascrizione) a volte anche repressori (sistema tet) il gene reporter sarà attivato o represso si usa il genoma su chips e si trova in quanti punti lega una prot. si usa un estratto nucleare e si trovano quali complessi vanno a legare un sito, con mass spettr. o immunoprecipitaz. si isolano le prot. del complesso

voglio trovare tutti i siti di legame di un fattore di trascrizione lo screening è possibile se con uno o più chips di microarray riesco a rappresentare tutte le regioni con tutte le variazioni (anche polimorfismi SNPs) dopo una analisi genomica “in silicio” per quel fattore di trascrizione. Cioè identificazioni di tutti i punti possibili del genoma con software predittivo per un fattore (si usano banche dati di tutti i siti (seq. di consensus) descritti e trovati per quel fattore

dal vitro al vivo cercare chi interagisce i metodi globali: con la genomica o post-genomica posso simulare “in silicio” (metodo elettronico) e fare uno screening da cui quello in umido sul banco sperimentale fenotipi e mutanti screening in vivoin vitro interattori il sistema biologico dinamico e interattivo