TERMINAZIONE IN PROCARIOTI ED EUCARIOTI

La Terminazione della Trascrizione

Vettore plasmidico per la trascrizione in vitro La trascrizione arriva alla fine del gene di interesse… Sito di aggancio per la polimerasi del fagoT7 T7 Gene di interesse T7 + T7 RNA polimersi e NTPs La polimerasi si aggancia al sito di inizio (non richiede fattori sigma) e inizia a trascrivere Vettore plasmidico per la trascrizione in vitro T7 …e continua fino a che sono disponibili i nucleotidi, trascrivendo tutto il plasmide, anche il proprio sito di inizio

+T7 RNA polimerasi e NTPs Il plasmide viene linearizzato mediante taglio con l’enzima di restrizione EcoRI, posto al 3’ del gene di interesse +T7 RNA polimerasi e NTPs EcoRI La polimerasi si aggancia al sito di inizio e inizia a trascrivere T7 La polimerasi trascrive il DNA fino alla fine del gene di interesse… T7 …e “precipita nel vuoto”in corrispondenza del sito di taglio, ovvero si stacca per mancanza del templato, rilasciando anche il trascritto T7

Nelle cellule la terminazione avviene attraverso processi differenti dalla trascrizione in vivo: il DNA rimane sempre integro I geni batterici possiedono dei terminatori della trascrizione. I Terminatori sono sequenze dell’RNA che promuovono il distacco dell’RNA polimerasi dal templato Ne esistono di 2 tipi -dipendenti da Rho -intrinseci

I terminatori Rho-dipendenti richiedono il legame della RNA elicasi Rho alla catena nascente di RNA Rho si lega all’RNA su uno specifico sito di riconoscimento, ma agisce al 3’ di questo

I terminatori intrinseci non richiedono nessun cofattore per la terminazione

La terminazione della trascrizione batterica puo’ essere modulata: Antiterminatori = Specifiche proteine che consentono alla RNA polimerasi di continuare la trascrizione attraverso il sito di terminazione Attenuatori = Sequenze dell’RNA che regolano la terminazione della trascrizione di un operone successivamente al primo gene trascritto

Il caso del fago lambda: Cascata di geni Infezione e attivazione del genoma di Lambda Geni precocissimi Geni precoci Geni tardivi Uno dei geni precocissimi (N) codifica per un antiterminatore che consente alla polimerasi di procedere oltre, trascrivendo cioe’ anche i geni precoci

N e Cro = geni precocissimi

Il ribosoma puo’causare questo evento

L’attenuatore batterico: il caso della sintesi del triptofano L’operone trp e’ costituito da una regione leader (che codifica per un piccolo peptide ricco in triptofano) e da trpE che codifica per un enzima della sintesi del triptofano. Le due regioni sono separate da un ATTENUATORE.

In assenza del triptofano il trp-tRNA non puo’ essere caricato sui ribosomi. Di conseguenza i ribosomi stallano sulla regione leader impedendo il corretto ripiegamento dell’RNA

In assenza di trp In presenza di trp

TERMINAZIONE IN EUCARIOTI

La terminazione negli eucarioti Le pol1 e pol3 hanno dei terminatori della trascrizione. I terminatori della pol1 sono sequenze di DNA che legano una proteina, la quale promuove il distacco della pol1 I terminatori della pol3 sono sequenze di poli-U nell’RNA La pol2 non ha terminatori, la terminazione avviene in modo differente ed e’ connessa alla stabilita’ alla capacita’ di essere tradotto dell’RNA messaggero.

Gli mRNA dei Batteri vengono tradotti durante il processo trascrizionale, e vengono degradati subito dopo L’attacco dei ribosomi all’mRNA avviene grazie ad una specifica sequenza posta nel 5’UTR: la sequenza di Shine-Dalgarno

L’mRNA eucariotico codifica per una sola proteina: non ci sono operoni L’mRNA e’ modificato alle due estremita’: cap e poliA

Durante l’allungamento la coda C-terminale della pol2 recluta gli enzimi per la sintesi del cap

Il cap serve per l’attacco ai ribosomi

Il cap viene legato dal fattore di inizio della traduzione eIF4F che contatta anche il poliA tramite PAPB Cap e poliA sono fondamentali per l’inizio della traduzione

Cap e poliA proteggono gli mRNA dalle esonucleasi

Per essere degradati, gli mRNA decono essere de-adenilati e il cap deve essere rimosso

Regolazione della stabilita’ del messaggero: il caso del metabolismo del ferro La Transferrina serve per far entrare il ferro nelle cellule Spazio extracellulare Membrana cellulare citoplasma La Ferritina serve per bloccare l’eccesso di ferro nelle cellule Transferrina e Ferritina agiscono in modo opposto sulla concentrazione di Ferro intracellulare

Il ferro citoplasmatico regola la traduzione degli mRNA per Transferrina e Ferritina

Terminazione della trascrizione: il caso dell’HIV

La trascrizione del genoma di HIV e’ regolata dall’antiterminatore Tat