Esempio di utilizzo del programma BLAST disponibile all’NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST Form di Nucleotide BLAST Per un uso più avanzato, si possono impostare parametri particolari (es. cost to open gap, cost to extende gap, penalty for mismatch ecc) Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

La risposta che si ottiene può essere suddivisa in 4 parti: Sequenza query La risposta che si ottiene può essere suddivisa in 4 parti: dati generali allineamento grafico listato delle sequenze con allineamento significativo dettaglio degli allineamenti ottenuti 1. dati generali 2. allineamento grafico Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

3. listato delle sequenze con allineamento significativo Ricordate che BLAST è un programma di allineamenti locali, quindi, per ogni confronto tra la sequenza query e una delle sequenza del database, potrebbero essere trovati più allineamenti differenti. Significato delle colonne Max score: punteggio dell’allineamento locale più significativo: punteggio alto  elevata similarità Total score: la somma dei punteggi di tutti gli allineamenti locali trovati tra la sequenza query e la sequenza del database Query coverage: percentuale della sequenza allineata E value: esprime la probabilità che l’allineamento trovato sia casuale. Più basso è maggiore è la probabilità che NON sia casuale. (dipende, oltre che dalla similarità, anche dalla numerosità delle sequenze in database) Max Identit: percentuale di identità dell’allineamento locale più significativo TTTCTCGACTGCAGAGAAA ||||| ||| |||||||| TTTCTAGACTGCAGAGAAA Identità =82% (16 / 19) Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

4. dettaglio degli allineamenti ottenuti ......continua con i dettagli degli altri allineamenti ..... Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

Risultato della ricerca (con la stessa sequenza nucleotidica) tramite BLASTX: ricerca di similarità in una banca dati di sequenze proteiche a partire da una sequenza query di nucleotidi, dopo aver tradotto automaticamente la query in aminoacidi utilizzando tutti i possibili frame di lettura. Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

ESEMPIO di BLAST 2 SEQUENCES Utilizziamo BL2SEQ con due sequenze nucleotidiche Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

Form dell’NCBI nel quale immettere le due sequenze da confrontare Visualizzazione dei risultati: dati generali Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

Zoom della regione di gap tra le due sequenze allineate Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

BLAT Blast-like alignment tool Programma specializzato in allineamenti di sequenze su interi genomi e sviluppato da J. Kent (Santa Cruz, CA). Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

BLAT Blast-like alignment tool Proviamo a fornire a BLAT la sequenza di un mRNA e a vedere dove e come si allinea sul genoma umano Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

RISULTATO di BLAT Si può visualizzare il risultato dell’allineamento selezionando il link ipertestuale browser. E si possono visualizzare i dettagli dell’allineamento selezionando il link ipertestuale details. Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

I dettagli riguardano sia la sequenza di input (mRNA) Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

Che le regioni della sequenza genomica che si allineano con l’mRNA In maiuscolo la sequenza di input (mRNA) In minuscolo e nero la sequenza genomica che non allinea: INTRONE, oppure regione intergenica. Gli introni di solito iniziano con GT e finiscono con AG Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014

BLAT contro BLAST BLAT mantiene in memoria un indice di un intero genoma: il database target di BLAT non è un set di sequenze GenBank, ma un indice derivato dall'assemblaggio dell'intero genoma. BLAT per gli acidi nucleici è scritto per individuare velocemente sequenze di 40 basi o più e con il 95% di similarità o più. Potrebbe non individuare allineamenti più divergenti o corti. BLAT per proteine individua sequenze proteiche con più dell'80% di similarità alla query lunga almeno 20 aa. In pratica, a causa del grado di divergenza tra sequenze nel corso dell'evoluzione: DNA BLAT lavora bene su uomo ed i primati, BLAT per proteine trova buoni match tra le proteine conservate di vertebrati terrestri e anche organismi più distanti filogeneticamente. Da un punto di vista pratico, BLAT ha diversi vantaggi rispetto a BLAST: * velocità (no code, risposte in secondi) ma ha una minore specificità * diverse modalità di ordinamento dell'output * collegamento diretto nel UCSC Genome Browser * dettaglio dei blocchi di allineamento nell'ordine naturale nel genomico BLAT viene solitamente usato per cercare la collocazione di una sequenze nel genoma o per determinare la struttura esonica di un mRNA. Informatica e Bioinformatica – A. A. 2013-2014