Aula Magna della Facoltà di Agraria, Università degli Studi di Perugia Caratteristiche microbiologiche, patogenetiche ed epidemiologiche di Legionella spp. Paola Borella Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica Università degli Studi di Modena e Reggio E. e-mail: borella.paola@unimore.it Giornata di studio “LA LEGIONELLOSI NELLE STRUTTURE OSPEDALIERE E TURISTICO-ALBERGHIERE” Perugia, 29 ottobre 2005 Aula Magna della Facoltà di Agraria, Università degli Studi di Perugia Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica

scoperta di un “nuovo” batterio denominato Legionella La storia Nell’estate del 1976 a Philadelphia si verificò un’epidemia di polmonite tra i partecipanti ad una riunione dell’American Legion: tra i 4.000 veterani del Vietnam presenti ( “Legionnaires”), 221 si ammalarono e 34 morirono scoperta di un “nuovo” batterio denominato Legionella

Classificazione Famiglia: Legionellaceae Genere: Legionella Specie: Legionella pneumophila e altre 47 specie

Specie e sierogruppi di Legionella 1. L. pneumophila 15 2. L. bozemanii 2 3. L. dumoffii 1 4. L. micdadei 1 5. L. longbeachae 2 6. L. jordanis 1 7. L. wadsworthii 1 8. L. hackeliae 2 9. L. feeleii 2 10. L.maceachernii 1 11. L.birminghamensis 1 12. L.cincinnatiensis 1 13. L.gormanii 1 14. L.sainthelensi 2 15. L.tucsonensis 1 16. L. anisa 1 17. L. lansingensis 1 18. L. erythra 2 19. L. parisiensis 1 20. L. oakridgensis 1 21. L. spiritensis 2 22. L. jamestowniensis 1 23. L. santicrucis 1 24. L. cherrii 1 25. L. steigerwaltii 1 26. L. rubrilucens 1 27. L. israelensis 1 28. L. quinlivanii 2 29. L. brunensis 1 30. L. moravica 1 31. L. gratiana 1 32. L. adelaidensis 1 33. L. fairfieldensis 1 34. L. shakespearei 1 35. L. waltersii 1 36. L. genomospecies 1 37. L. quateirensis 1 38. L. worsleiensis 1 39. L. geestiana 1 40. L. natarum 1 41. L. londoniensis 1 42. L. taurinensis 1 43. L. lytica 1 44. L. drozanskii 1 45. L. rowbothamii 1 46. L. fallonii 1 47. L. gresilensis 1 48. L. beliardensis 1 Fields BS. Legionella and Legionnaires’ disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev 2002;15(3):506-26.

Legionella pneumophila constituted 91.5% of the isolates. Victor L. Yu et al. Distribution of Legionella species and serogroups isolated by culture in patients with sporadic community-acquired legionellosis: an international collaborative survey. J Infect Dis. 2002 Jul 1;186(1):127-8. This international collaborative survey identified culture-confirmed legionellosis in 508 patients with sporadic community-acquired legionellosis. Legionella pneumophila constituted 91.5% of the isolates. Serogroup 1 was the predominant serogroup (84.2%), and serogroups 2–13 (7.4%) accounted for the remaining serogroups. The Legionella species most commonly isolated were L. longbeachae (3.9%) and L. bozemanii (2.4%), followed by L. micdadei, L.dumoffii, L. feeleii, L. wadsworthii, and L. anisa (2.2% combined). L. longbeachae constituted 30.4% of the community-acquired Legionella isolates in Australia and New Zealand.

Caratteristiche morfologiche e tintoriali Microrganismi di forma bastoncellare o coccobacillare (osservazione prelievi clinici) Dimensioni di 0,3-0,9 m x 2-4 m (forme filamentose di 20 m e oltre in coltura) Non sporigeni, non capsulati Gram-negativi, si colorano debolmente in rosso con safranina Immobili o mobili per mezzo di un flagello polare Possiedono fimbrie

Caratteristiche di crescita Temperatura di crescita Legionella si moltiplica tra 25°C e 42°C con temperatura ottimale di 35°C PH di crescita Il pH ottimale di crescita è leggermente acido ( tra 6,85 e 6,95 ), ma è tollerato un pH sino a 5,5 Respirazione Sono batteri aerobi, ma la loro crescita in terreni artificiali è favorita dalla microaerofilia ( presenza del 2,5% di CO2 ) soprattutto nel primo isolamento

Esigenze nutritive Le esigenze nutritive sono soddisfatte dal citoplasma dei protozoi all’interno dei quali si riproducono alle adatte temperature Per la loro moltiplicazione in terreni sintetici richiedono vari fattori di crescita: ferro organico, cisteina e fattori presenti nell’estratto di lievito

Caratteri biochimici Tabella - Caratteristiche delle specie di Legionella ________________________________________________________________________________________________ Crescita su Catalasi Ossidasi Riduzione Ureasi Acidificazione Gelatinasi -lattamasi BCYE Agar-sangue di NO3 del glucosio L.pneumophila + - + + - - - + + L.micdadei + - + + - - - + + L.bozemanii + - + - - - - + +/- L.dumoffii + - + - - - - + + L.gormanii + - + + - - - + + L.longbeachae + - + + - - - + + L.wadsworthii + - + - - - - + + ____________________________________________________________________________________________________________________ In terreni artificiali, le legionelle sono biochimicamente poco attive. Terreni zuccherati: non acidificati Urea: non idrolizzata Nitrati: non ridotti Gelatina: idrolizzata (tranne L. feeleii )

Ambiente naturale Le legionelle sono batteri dell’ambiente naturale acquatico. Sono presenti in: - Fiumi - Laghi - Stagni - Raccolte d’acqua superficiali di qualsiasi entità - Suolo umido La concentrazione delle legionelle nell’ambiente è usualmente bassa

Legionella sopravvive negli ambienti acquatici come parassita intracellulare di protozoi a vita libera La scoperta del ruolo dei protozoi (14 specie di amebe, tra cui Naegleria e Acanthamaebae, due specie di flagellati tra cui Tetrahymena ed una specie di muffa gelatinosa) come serbatoio per la moltiplicazione e la sopravvivenza delle legionelle ha permesso di comprendere l’epidemiologia e l’ecologia di questi batteri. A 20 °C, i protozoi fagocitano le legionelle e le digeriscono in gran numero. A 35°C, le legionelle fagocitate si moltiplicano all’interno dei protozoi.

Ciclo vitale di L. pneumophila Vita libera: batteri flagellati e mobili Aderenza alle cellule ospiti: protozoi o macrofagi Ingestione da parte della cellula ospite Perdita del flagello nel citoplasma Occupazione di un vacuolo e formazione di un unico fagosoma che non si fonde con il lisosoma Il fagosoma si trasforma in un comparto con reticolo simil-endoplasmatico Fase replicativa: i batteri non ciliati si moltiplicano nel reticolo simil-endoplasmatico del fagosoma Fase infettiva: il fagosoma si fonde con il lisosoma e libera batteri ciliati ed attivamente mobili la cellula ospite muore ( i protozoi per necrosi, i macrofagi e le cellule alveolari per apoptosi o per necrosi).

Le legionelle, di per se stesse, sono poco resistenti agli agenti fisici e chimici All’interno dei protozoi, e soprattutto all’interno delle cisti, sono molto resistenti agli aumenti di temperatura e ai biocidi Nell’ambiente sopravvivono per molti mesi se sono all’interno dei protozoi

Ambiente urbano - Rete di distribuzione dell’acqua Sistemi di condizionamento e umidificatori (torri di raffreddamento/condensatori evaporativi) Fontane decorative, impianti termali, vasche per idromassaggi, bagni turchi e aree adibite a sauna, sistemi di irrigazione, acque di scarico di impianti igienici - Piscine e cisterne con acqua stagnante - Apparecchiature per inalazioni Gli ambienti idrici artificiali agiscono da amplificatori e disseminatori

Modalità di contaminazione Poche cellule microbiche entrano negli impianti e si riproducono (20-45°C)  RUOLO ESSENZIALE DELL’ACQUA CALDA

Fattori favorenti la colonizzazione di ambienti idrici artificiali temperatura dell’acqua fenomeni di ristagno/ostruzione incrostazioni torbidità, sostanze organiche, biofilm, Zn materiali (guarnizioni di gomma) presenza di alghe e amebe acquatiche Altri fattori sospetti durezza dell’acqua altri germi e materiali biodegradabili situazione climatica vibrazioni/cambiamenti di pressione nel sistema idrico

Biofilm Un biofilm è costituito da aggregati di batteri, protozoi e miceti che aderiscono a irregolarità delle pareti interne di condutture ed altre strutture a contatto con l’acqua, formando delle stratificazioni che hanno l’effetto di corrodere le pareti stesse, facilitando depositi ed incrostazioni che sporgono e tendono ad occludere le tubazioni

Biofilm La presenza del biofilm è essenziale per la colonizzazione da parte delle legionelle, che trovano in esso i protozoi entro cui moltiplicarsi e svolgere il loro ciclo vitale

Particolarità delle strutture turistiche Fattori di rischio aggiuntivi nelle strutture turistiche Particolarità delle strutture turistiche - sistema di distribuzione dell’acqua molto complesso (ogni stanza ha il bagno) con percorsi lunghi dal sito di distribuzione ai rubinetti - soggiorni brevi, variabilità nell’uso in base alla stagione: in alta stagione consumo di acqua concentrato in certe ore del giorno e notte (calo della T° dell’acqua) in bassa stagione, scarso consumo o albergo chiuso con possibile ristagno che facilita la formazione di biofilm la qualità dell’acqua erogata può variare e dovrebbe essere monitorata più frequentemente scarsa conoscenza del problema da parte del personale dei servizi tecnici dell’hotel

Letteratura

Letteratura

Ruolo della flora batterica acquatica nell’ecologia microbica di L Ruolo della flora batterica acquatica nell’ecologia microbica di L. pneumophila INTERAZIONI DIRETTE competizione e produzione di batteriocine INDIRETTE interazioni con i protozoi Screening su 72 ceppi di Pseudomonadaceae: 64% PRODUTTORI DI BATTERIOCINE attive contro L. pneumophila Nei confronti dei protozoi batteri possono: Fungere da nutrimento  favorire le legionelle Parassitarli  sfavorire le legionelle Messi P, Guerrieri E, Bondi M, Borella P. Interferenza microbica: quale ruolo nell’ecologia di Acanthamoeba polyphaga e Legionella pneumophila? Atti del 41° Congresso Nazionale SItI “Obiettivo salute: l’evoluzione cultuale in Europa” Genova, 20-23 ottobre 2004.

Interferenza microbica e sviluppo di biofilm in vitro P. aeruginosa  produce PIOCINE ma non influisce su L.p. P. fluorescens  produce una BATTERIOCINA e inibisce L.p. A. lwoffii  non produce alcuna sostanza e promuove L.p. Messi P, Bondi M, Marchesi I, Borella P, Guerrieri E. “Role of direct bacterial interference and biofilm in Legionella pneumophila water ecology” Atti del 20th Annual Meeting of EWGLI, 2005

La trasmissione interumana non è stata dimostrata Modalità di infezione Per inalazione di aerosol contaminati Per aspirazione di acqua contaminata Per inalazione di particelle di polvere da essi derivate per essiccamento Non si contrae bevendo acqua contaminata La trasmissione interumana non è stata dimostrata

Modalità di infezione La legionellosi si contrae generalmente via respiratoria mediante inalazione o microaspirazione di aerosol contaminato L’aerosol si forma attraverso le goccioline generate dagli spruzzi d’acqua o dall’impatto dell’acqua sulle superfici Più le goccioline sono piccole (< 5 micron) più facilmente raggiungono le basse vie respiratorie

Fattori di rischio per l’infezione ESPOSIZIONE: tipo e intensità: carica batterica, grado di aerosolizzazione dell’acqua, vicinanza alla sorgente di aerosol VIRULENZA DEL CEPPO: diversa capacità di sopravvivere e moltiplicarsi nei serbatoi ambientali ed umani (macrofagi) SUSCETTIBILITA’ INDIVIDUALE: anziani, fumatori, soggetti con malattie croniche, immunocompromessi e con prolungata degenza ospedaliera

Fattori di rischio per infezione Sesso M:F = 2-3:1 Età media =55 aa, il 60% dei pazienti ha più di 50 aa Rara nei bambini, poco frequente nei giovani adulti Il 40% dei soggetti ha patologie croniche concomitanti

Rapporto infetti/malati Essendo un microrganismo opportunista, la maggior parte degli individui sani supera l’infezione senza manifestare sintomi di malattia conclamata, ma i meccanismi di protezione e/o suscettibilità non sono conosciuti

Origine dei casi I primi casi di legionellosi sono stati ricondotti ad aerosol provenienti da impianti di climatizzazione Le infezioni più recenti sono state causate da contaminazione di: impianti di distribuzione dell’acqua (docce, rubinetti, fontane, impianti termali, idromassaggi) apparecchi per aerosol, ossigenoterapia e per la respirazione assistita Numerosi clusters epidemici vengono segnalati per la diffusione di aerosol contaminati da torri di raffreddamento di grandi edifici Segnalati casi acquisiti attraverso ferite Segnalato un caso in un bambino a seguito del parto in acqua

I quadri clinici La Malattia dei Legionari è la forma più severa dell’infezione Si presenta come una polmonite acuta purulenta difficilmente distinguibile da altre forme di infezioni respiratorie acute delle basse vie aeree La Febbre di Pontiac è una manifestazione acuta simil-influenzale che non interessa il polmone

Malattia dei Legionari Incubazione da 2 a 10 giorni (forse fino a 15gg) Prodromi (malessere, mialgie e cefalea) cui segue febbre alta, tosse non produttiva, sintomi comuni ad altre forme di polmonite Possono essere presenti sintomi extrapolmonari utili ad indirizzare la diagnosi, quali manifestazioni neurologiche, renali e digestive Il reperto radiologico toracico non è patognomonico La diagnosi definitiva può essere raggiunta solo con indagini di laboratorio

DIAGNOSI Isolamento colturale (escreato, sangue, BAL, tessuti post-mortem) con terreni di coltura selettivi e tempi di crescita lunghi (4-10 giorni) Ricerca dell’antigene solubile nelle urine di L. pneumophila sierogruppi 1-14 Sieroconversione (almeno 10gg) Immunofluorescenza diretta PCR

Alcune osservazioni L’aumentata consapevolezza della malattia fra i medici e l’uso dei test per la ricerca dell’antigene urinario ha incrementato la individuazione dei casi sostenuti da L.pneumophila Il gold standard resta tuttavia l’isolamento colturale che consente: a) di riconoscere tutte le infezioni b) di risalire alle fonti ambientali, attraverso l’analisi molecolare dei ceppi clinici ed ambientali isolati

Terapia I macrolidi quali claritromicina e azitromicina o i fluorchinolonici (levofloxacina) sono i farmaci più idonei per la loro capacità di concentrarsi nei macrofagi e nei tessuti polmonari La loro associazione è particolarmente utile nei pazienti fortemente immunocompromessi La terapia deve essere prolungata per almeno 3 settimane

Antibiotico resistenza Antibiotici quali la eritromicina, fluorchinolonici e rifampicina possono non risolvere la malattia, ma non sono segnalati fenomeni di resistenza negli isolati clinici di L. pneumophila. Dalle indagini sperimentali tutti i ceppi saggiati (ambientali e clinici) sono risultati sensibili ai farmaci di elezione. La mancanza della fase di colonizzazione prima dell’infezione (manca il portatore) minimizza il rischio di resistenza alle Legionellaceae in ambiente ospedaliero. Manca la pressione selettiva nell’ambiente naturale del microrganismo che è rappresentato dall’acqua contaminata. La possibilità di comparsa di resistenze suggerisce tuttavia di testare la sensibilità delle legionelle agli antibiotici che si intendono utilizzare per la terapia.

Altre forme di legionellosi Febbre di Pontiac La Febbre di Pontiac è una manifestazione acuta simil-influenzale che si risolve in 2-5 giorni, con tosse nel 30-60% dei casi e dolore toracico in assenza di interessamento polmonare. Si pensa sia dovuta ad una reazione ad antigeni batterici inalati, piuttosto che ad una vera e propria infezione. Incubazione 24-48 ore Forme subcliniche Il frequente riscontro di anticorpi anti-Legionella spp ( 15% nella popolazione generale, dati personali) in assenza di episodi di polmonite fa ritenere che la legionellosi si possa manifestare come forma subclinica

Definizione di caso Caso accertato infezione respiratoria con E.O. positivo per polmonite focale e/o esame radiologico suggestivo di interessamento polmonare,accompagnato da 1 o più dei seguenti criteri: isolamento di Legionella da materiale organico (secrezioni, tessuto polmonare, liquido pleurico o sangue) aumento di almeno 4 volte del titolo anticorpale verso L. pneumophila sierogruppo 1 tra 2 sieri prelevati a distanza di almeno 10 giorni riconoscimento dell’antigene specifico solubile nelle urine

Definizione di caso Caso presunto infezione respiratoria con E.O. positivo per polmonite focale e/o esame radiologico suggestivo di interessamento polmonare, accompagnato da 1 o più dei seguenti criteri: aumento di almeno 4 volte del titolo anticorpale relativo a sierogruppi o specie diverse da L. pneumophila sierogruppo 1 positività all’immunofluorescenza diretta effettuata su materiale patologico singolo titolo anticorpale elevato (1:256) verso L. pneumophila sierogruppo 1

Definizione di Caso nosocomiale Caso confermato da test di laboratorio, in cui il paziente è stato ricoverato continuativamente in ospedale per almeno 10 giorni prima dell’esordio della malattia Se il periodo di ospedalizzazione è compreso fra 2 e 9 giorni, il caso è considerato di possibile eziologia nosocomiale Se 2 o più casi si verificano nello stesso ospedale nell’arco di 6 mesi, vengono considerati una epidemia ospedaliera Linee Guida nazionali

Classificazione dei casi 1 - Casi nosocomiali 1999 Europa 9% 2004 Italia 16,0% Rappresentano una % limitata dei casi notificati, ma hanno letalità più elevata (circa 22-30% vs 10% nei casi comunitari) 2 - Casi associati ai viaggi 1999 Europa 21% (15% associati a viaggi all’estero) 2004 Italia 13,6% 3 - Altri Casi comunitari 1999 Europa 70% 2004 Italia 70,4% Per la maggior parte di questi non è possibile risalire alla sorgente di infezione

Caratteristiche epidemiologiche delle legionellosi L’incidenza reale delle legionellosi nella popolazione è sconosciuta: nonostante l’aumento delle segnalazioni, l’incidenza dei casi notificati resta bassa Casi attesi (stima): 1-5% di tutti i casi di polmoniti comunitarie 3-20% di tutte le polmoniti nosocomiali Sulla base di queste indicazioni in Italia i casi incidenti potrebbero essere 1.000-10.000/anno

Motivi della sottostima la diagnosi etiologica delle polmoniti non è generalmente richiesta la diagnosi di legionellosi richiede test specifici non effettuati di routine i medici non sono sempre allertati

Motivi di preoccupazione Aumento nella popolazione delle persone a rischio Aumento negli ospedali di pazienti e procedure a rischio Difficoltà ad eradicare Legionella dai serbatoi contaminati Mancanza di metodi ottimali per prevenire la legionellosi

Aspetti critici della legionellosi A) difficoltà nella identificazione dei casi e nella ricerca delle fonti ambientali B) insufficiente conoscenza sulla reale prevalenza della infezione/malattia C) poche informazioni sui fattori di rischio coinvolti nella infezione/malattia e nessuna sulla predisposizione genetica D) limitate conoscenze sugli eventi molecolari e biochimici che permettono la sopravvivenza/moltiplicazione di Legionella nelle cellule umane e nei reservoirs ambientali E) difficoltà a controllare/eradicare Legionella spp applicando metodi di disinfezione efficaci