Lezione 15 - 16 mercoledì 20 aprile 2011 corso vettori biologici II Biotec industriali ore 14:00 -16:00 aula 6A

La reazione a catena della DNA polimerasi PCR “polymerase chain reaction” Descrizione della tecnica, metodo, componenti, variabili, strumenti = termociclatori Tecnica: amplificazione esponenziale a cicli successivi tramite DNA polimerasi (adesso e’ termo resistente) DNA polimerasi di “thermophilus aquaticus” (Taq polimerasi) - salto di qualita’ del metodo, molto piu’ efficiente. Le applicazioni si sono moltiplicate nella ricerca biologica e medica, nella diagnostica e medicina forense (legale) Il principio sfrutta l’efficienza (velocita’ di sintesi) della DNA polimerasi utilizzando due inneschi (primers) artificiali scelti dallo sperimentatore sulla sequenza da amplificare (modo esponenziale).

Come si fa la PCR, in cosa consiste Reazione a Catena di Polimerizzazione RCP PCR amplificazione tramite sintesi de-novo di nuovi filamenti di DNA da parte della DNA polimerasi di Thermophilus aquaticus - definizione: reazione ad amplificazione esponenziale con un raddoppio teorico della quantità di DNA ad ogni ciclo di sintesi. La DNA polimerasi di cosa ha bisogno ? - del templato denaturato a singolo filamento (forca replicativa?) dei primers (inneschi) dei nucleotidi per la sintesi del tampone del Magnesio

le tre temperature 1 denaturazione del DNA a 94°C 2 appaiamento (“annealing”) dei primers al ssDNA templato, temperatura misurata sulla t° di denaturazione dei primers 3 temperatura ottimale di sintesi della Taq polimerase 72°C che eviti rinaturazione e amplificaz. aspecifiche alla fine del ciclo prima si doveva riaggiungere la polimerasi ogni fase del ciclo può durare da 30” ad 1’ o più minuti secondo la lunghezza del frammento da amplificare (oltre 1’ per più di 2 kb fino a 10’ per 10 kb)

applicazione del sistema naturale la sintesi del DNA è semiconservativa (duplicazione) le DNA polimerasi e anche le RNA pol sintetizzano tutte sullo stesso modello di funzionamento: con il verso 5’- 3’ su uno stampo (templato) antiparallelo 3’-5’ partendo dal 3’ libero di un innesco (primer) appaiato sul templato 3’ 5’ primer neosintesi anche in vitro si può sfruttare il metodo naturale di sintesi

l’invenzione geniale dalla amplificazione lineare a quella esponenziale: la sintesi in vitro di DNA già era stata usata anche per le reazioni di sequenziamento, ma solo per una delle due eliche 3’ 5’ primer neosintesi se aggiungiamo un primer sulla catena complementare: 3’ 5’ neosintesi otteniamo una amplificazione di tutte e due le eliche, e poi ? se la reazione coninua è esponenziale !

attenzione al verso dei primers la doppia elica di DNA ha i due filamenti antiparalleli dovuti al sistema che è stato selezionato in origine con le polimerasi degli acidi nucleici che sintetizzano tutte nello stesso verso 5’ 3’ da un 3’ libero e su un templato 5’ 3’ 5’ 3’ sintesi denaturazione dopo la sintesi si otterrano 2 doppie eliche identiche alla prima

se la reazione in vitro continua 5’ 3’ 1 doppia elica 5’ 3’ denaturazione sintesi 2 doppie eliche 5’ 3’

diventa una reazione esponenziale 2 x 2 = 4 4 x 2 = 8 1 x 2 = 2 la tabellina del 2 ma come è possibile fare avvenire la reazione senza farla fermare ? da sola una doppia elica non si duplica se non si ha la separazione (denaturazione) delle due eliche neosintetizzate !

Il ciclo (non il velocipede) Primer frw. Denaturazione = seq + + _ 5’ 3’ 2 eliche Primer rev. 3’ 5’ = seq - Annealing a ~ 50°- 60° C pr. rev. 5’ 3’ pr. frw. 3’ 5’ Extension (Polimerizzazione) 3’ 5’ 5’ 3’ I CICLO 5’ 3’ 3’ 5’ Denaturazione 5’ 3’ 4 eliche 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

Ciclo continuo 32 eliche….. Annealing Extension (Polimerizzazione) 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ II CICLO 4 eliche 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Denaturazione 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 8 eliche 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ IV ciclo III CICLO 16 eliche 32 eliche….. La crescita e’ esponenziale : teoricamente ad ogni ciclo un raddoppio di DNA, ma dipende dalla messa a punto del protocollo di reazione, molte variabili da ottimizzare - senza contaminazioni amplificazione da quantita’ minime di DNA (famtogrammi o singole cellule) - genoma diploide 2 doppie eliche di templato in interfase

Le condizioni di reazione di ogni passaggio vanno determinate per i tempi, temperature e quantita’(conc.) ogni ciclo = 3 passaggi (fasi) I passaggio denaturazione (5-10 min. quella iniz. della reazione) II passaggio appaiamento dei primers (annealing) III passaggio di sintesi del DNA, estensione del filamento di DNA a partire dai primers (inneschi) Fine del ciclo Alla fine dei cicli programmati viene fatta una estensione di 5 -10 min. per assicurare il completamento della sintesi di tutti i nuovi frammenti iniziati e non terminati

i reagenti della reazione enzimatica l’enzima sarà una Taq polimerasi (ne esistono diverse ottenute da mutanti che aumentano la specificità, efficienza e lunghezza del frammento amplificato il DNA templato sufficientemente purificato se genomico ad alto peso molecolare i primers di sintesi prodotti da ditte specializzate (15-25 bp) la concentrazione del Mg di solito 1,5 mM il Buffer ottimale per la polimerasi H2O per portare al volume finale di reazione ~ 50 microlitri

Le componenti per la reazione: Volume di reazione: da 10 a 50 ml (max 100 l) per una preparativa. Il DNA (templato), abbastanza pulito, non deve essere purissimo, la quantita’ puo’ essere molto poca, normamlmente si usano 10-100 ng di un genoma eucariotico, più di 500 ng possono inibire della reazione La Taq polimerasi, DNA polimerasi di “thermophilic eubacterium thermus acquaticus” resiste a 95°, frequenza di errore superiore a quelle di eucarioti, 26 x10- 6, ora ce ne sono per diverse finalita’, a basso tasso di errore = high fidelity 8.5 x10- 6, e per frammenti lunghi genomici. Se ne usa da meno di 1U fino a 5 U, ma se si fanno molti cicli conviene spezzare la reazione in due fasi e riaggiungerla dNTPs: conc. standard 100 M per ognuno Il tampone: sale di Tris, il Mg concentrazione empirica tra 0. 5 mM e 4. 5 mM, ogni Taq pol. ha un tampone con concentrazioni saline (buffer) ideali I primers: scelti per funzionare in coppia, evitare GC ed AT finali, palindromi, sequenze complementari, devono avere TM(melting) simili, H2O q.b. sterile incontaminata per arrivare al volume finale

nel caso del pyrosequencing la PCR si utilizza per amplificare i frammenti random da sequenziare a cui sono stati attaccati dei primers tramite ligasi e che fanno da inneschi, prima per la PCR e poi per la reazione di pirosequenziamento delle palline collocate nelle celle in cui entra una pallina solamente. La reazione è colorimetrica tramite un metodo che vedremo più avanti

applicazioni della PCR RT-PCR, nested PCR RACE 3’ e RACE 5’ PCR inversa Mutagenesi Pcr quantitativa e semiquantitativa competitiva variazioni sul tema PCR multiplex Real Time PCR abbreviata = RT-PCR da non confondere AFLPs (uso di adapters anche col random sequencing e PCR) 3C = chromosome conformational capture e varianti

Ricerca di un vettore Cosa cambia? Per inserzione random nel genoma Per inserzione sito specifica nel genoma Cosa cambia?

Cambia la regione limitrofa Gene targeting deve avere regioni limitrofe note a) Random recombination ha regioni limitrofe ignote b) Due tipi di PCR per poter fare l’analisi delle regioni limitrofe PCR classica con primers interni ed esterni alla regione che ricombina col vettore b) PCR inversa per identificare le regioni limitrofe

Altre possibilità di analisi tramite PCR perfezionamenti delle tecniche e degli enzimi - nuove macchine con determinazione in tempo reale (real-time PCR) tramite laser (light-cycler) del DNA o cDNA amplificato proporzionale al templato iniziale presente nel campione in analisi. Questa è la PCR quantitativa, diversa dalla PCR semiquantitativa o competitiva. La PCR quantitativa da un valore assoluto rispetto ad un amplicone di riferimento a quantità nota con la così detta curva di taratura da cui si ricava un c/t value (threshold cycle)

Altre possibili applicazioni della PCR - abbiamo visto RT-PCR tramite reverse transcriptase da mRNA RT-PCR è il metodo per determinare l’espressione o meglio la trascrizione di un gene - alternativa all’analisi Northern ma non determina la lunghezza del mRNA, solo la presenza e volendo la quantità trascritta

applicazione RT-PCR nuovo esercizio: se devo retrotrascrivere un mRNA per ottenere un un cDNA devo fare prima una retrotrascrizione con random priming con esanucleotidi e poi la PCR per vedere se il gene è espresso (trascritto) esperimento sostitutivo di un Northern, ma non dice la lunghezza del messaggero i primers come li scelgo ? : sulla sequenza coding che è quella depositata in banca dati e che non è il cDNA che sarebbe il DNA complementare all’mRNA dopo retrotrascriz. quindi si selezionano i primers come per una normale PCR purchè si abbia la sequenza corrispondente a quella coding = al mRNA = sequenza codificante (quella in banca dati)

La reverse trascrittasi RT L’uso della reverse trascrittasi risale a quando furono scoperti i meccanismi molecolari con cui i virus ad RNA si replicavano all’interno delle cellule infettate. Le più utilizzate sono quelli della Murine Moloney leukemia virus MMLV, Avian myeloblastosis virus AMV che poi sono state anche trasformate per resistere meglio ad alta temperatura per fare la “one step RT-PCR” Oltre alle RT anche le Taq polimerasi sono state migliorate per efficienza ed affidabilità (riduzione di errori di sintesi).

RT-PCR: cosa si analizza = analisi della trascrizione di un gene o isolamento di un cDNA senza Northern blot o screening di una cDNA library (si deve avere una sequenza nota). La RT-PCR: da RNA totale di cellule per verificare che sia trascritto quel particolare gene. Basta una quantità di RNA molto piccola a differenza di un northern dove per ogni corsa ci occorrono 2-3 mg di poly A mRNA o 7-10 mg di RNA totale. Nel caso di una cDNA library la quantita’iniziale di RNA e di lavoro e’assai maggiore. RT-PCR classica: - Primo filamento o con primer di oligo dT o random priming con esanucleotidi. - L’enzima funziona a 37°C; mutanti resistono fino a 60°C. Si retrotrascrive tutto l’mRNA o tutto l’RNA, nel caso in cui i trascritti siano molto lunghi e l’enzima potrebbe non completare la retrotrascrizione a partire dal polyA. - Dall’RNA va eliminato il DNA genomico. - Dopo la sintesi del primo filamento di DNA si puo’ far partire una normale PCR, ma si fa un trattamento di RNase per eliminare l’RNA, gli esanucleotidi e l’oligo dT; ci sono protocolli in cui si fa un’unica reazione perche’ la temperatura della PCR e’ selettiva e la Taq hot-start non si attiva prima di essere portata oltre 70°C.

stratagemmi della RT-PCR Accorgimento: quando si estrae l’RNA si deve evitare il DNA e si puo’ fare un trattamento di DNAse, e/o scegliere i primers a cavallo di due esoni I filamento con rev transcript. a bassa temp. II filamento con Taq polymerase, I coppia di primers (sulla sequenza del mRNA). Non si vede tutto il trascritto, come in un Northern, non se ne puo’ valutare il peso, ma solo se quel frammento e’ trascritto (cioe’ se c’e’ quel mRNA), non si vede lo “splicing” alternativo salvo scelta dei primers su esoni diversi Valgono tutte le cose che si sanno per la PCR compreso rischio di amplificazioni aspecifiche, la reazione va messa a punto ogni volta. A differenza del Northern la buona amplificazione del frammento (amplicone) puo’ dipendere non solo dal fatto che c’e’ molto mRNA, ma anche dall’efficienza della PCR, quindi così non e’ quantitativa.

la retrotrascrizione Per RT si intende reverse transcriptase su templato di RNA Per avere un cDNA (DNA complementare ad un RNA messaggero) si deve retrotrascrivere l’mRNA cioe’ farlo diventare DNA I retrovirus ad RNA fanno la sintesi del DNA complementare al loro cromosoma ad RNA tramite una DNA polimerasi specifica che usa come templato RNA anziche’ DNA. Pero’ sempre con la sintesi in direzione 5’-3’come ogni polimerasi. L’enzima “reverse transcriptase” o trascrittasi inversa che si utilizza non e’ termoresistente, ma deriva da un retrovirus eucariotico, AMV avian myeloblastosis virus, M-MuLV Moloney leukemia virus murino ed anche altri. Piu’ recentemente sono state isolate e clonate delle RT mutanti che resistono a temperatura piu’ alta di 37°C fino a 60°C per aumentare specificità. Le tecniche precedenti per lo studio della trascrizione erano l’analisi Northern e l’isolamento dei cDNA da libraries clonate in vettori vari.

Analisi della trascrizione tramite PCR vantaggi della RT-PCR Analisi della trascrizione tramite PCR Analisi a partire da piccole quantità di RNA totale, svantaggio: non si sa la lunghezza del cDNA o mRNA Analisi della trascrizione e non determinazione del PM dei trascritti (Northern) Analisi dei livelli di trascrizione più fine per la sensibilità del metodo, se si vedessero tramite Northern le stesse quantità il Northern sarebbe più informativo (anche PM) Ampliconi possibilmente a cavallo di introni, perché ?

come si fa una RT-PCR Si deve ottenere il retrotrascritto cioè il cDNA ( DNA complementare all’ mRNA) Si parte da estratti di RNA totali o arricchiti per poly +(A) su resina con oligo dT La retrotrascrizione può avvenire con primers di esanucleotidi random o con poly T, a seconda della lunghezza dei trascritti e se si vogliono tutte le regioni trascritte o sempre a partire dal 3’ poliadenilato. RNA è molto instabile e vanno usati degli inibitori delle Rnasi per evitare che si degradino. Il cDNA è molto più stabile e si conserva meglio e più a lungo. Il cDNA si utilizza per la PCR però c’è un solo filamento complementare al trascritto con senso 5’-3’ inverso.

RT-PCR dal II filamento in poi Accorgimenti e controlli della RT-PCR Prima di retrotrascrivere il cDNA si tratta l’RNA con DNAse per eliminare ogni traccia di DNA genomico che potrebbe dare falsi positivi. Ottenuto il cDNA dalla reverse trascrittasi si passa alla PCR vera e propria con i primers specifici della regione del messaggero che vogliamo amplificare. Come accorgimento si può (si deve quando è possibile) amplificare un amplicone che comprende due porzioni di due esoni diversi e così non si amplifica il frammento di DNA genomico che è molto più lungo in quanto contiene l’introne. Naturalmente la lunghezza dell’amplicone è sempre ragionevole e non c’è nessun bisogno di amplificare esoni interi, ma sequenze dalle 150 alle 500 pb.

genomic & coding sequence, mRNA, cDNA genomic sequence con esoni ed introni 5’ 3’ coding sequence, solo esoni (gene bank) 5’ 3’ mRNA = coding sequence 5’ 3’ cDNA primo filamento 5’ 3’ RT PCR su cDNA a due filamenti 5’ 3’ 3’ 5’

Correzione parametri di una PCR La PCR deve dare dei prodotti che corrispondono agli attesi Quando i prodotti non sono gli attesi: Smear - poca specificità nonostante i primers specifici si gioca sulla temperature di “annealing”, temp. su cicli troppo lunghi rendono aspecifica l’amplificazione Bassa amplific. - stringenza “annealing” alta, temp. giù - ciclo troppo corto, allungare tempi di annealing o extension Ritocco dei parametri del protocollo, le variabili, il ciclo,

sequenza di un cDNA dalla banca dati per aumentare specificità? facciamo una doppia PCR : la seconda interna alla prima = nested PCR se abbiamo provato ad ottimizzare in ogni modo la nostra PCR e vediamo che si amplificano altri frammenti si prova a fare una seconda PCR sul primo prodotto con nuovi primers amplificazioni aspecifiche, peso molecolare diverso dall’amplicone prescelto

la sequenza 5’- 3’ di un cDNA GGATCCCTGT TCCTGATCAC TGATCTCTGG TTCTTTTATT ATGCATATTC 50 ATTTTGAAAT CTGATTCCTT TTCTGAGCAT GTATCAGTCT GACTAGACAC TGAGTCCTGT CTGATTTCTG AGCCTTGGCC CTCATGAGTA AGTGACCTGC AGTGGTGGAG GGAGCTCCAG GGGAGCCGAG ACCCTCTCAG TGCATGTACT CACTGGTAGA TGAAGAAATG ACCCCAATGA TTGCTCCATT CTTCCAGGCT CAGAGGGGTG TGTAGGCCCC AGGAGGACTT GGTGGGGAGA AGACCAGCCC AGGCCCTGTG AGTACACCCA GCCCCAGCCC CTAAGGGGTC GCCAGGTCTC GACTTAGCAC TGGGGAGGGG GTACAGTACA GGAGTGGGGA CAGGAAGGTG AGGGGAGGCC ATGCCGTTTG TATTCTCTTG CTTTTCTCTC TCTCCTGAAG CCTCTTGAAT AGACCTGCAG AAATACCCAA AATAGCCCTG TGGGGTGGCT 500 GAGTCATTGT GAACACAGCC CAGGTCAGGT GTTCCAGCCA GAGAACTGCT GTTCTGAGAA ACATGCCCCA AAACCGAGAC CTGGCCAGGT GTGCCTGGGG CCTGAGCGAG GGGCTGCAGC CACAGGTAGG CCCAGCCCCA ACCAGCCCAG AGTCAGCTAG GGCTTTCCAG GTCCAGGGTT AGGCAGAGGT CAGCCAGGGT CAACCACGGT CTATCTGAGG GGAGAGACAA GAGACACAGA GACATAGAGA GAGAGAGACA GGGATGGGGA GAGACAAGAG AGACAGGAAA GGAGAGACAA AGACAGACAC AGAGAGAGAG ATGGGGATGG AGAGAGATAA GAGACAGGGA CAGGGAGGGA CAGAGGCGAG GCCAGTGACA GAGACAGAGT TACAAGAGAC AGAAAGAGAG AGAGATGAGA TGAGAGAGAT CAGAAGAAAC GGAGACACAG ATGGGAGAAA AAGAGAGGAG ATGGGAACAG GAAAAAGAGA CATGGAGACA 1000 calcolate: la T°C e lunghezza ampliconi da bp a bp scrivete i primers da 5’ a 3’ I coppia rossa amplicone + lungo II coppia celeste nested amplicone + corto

una nested PCR determinare lunghezza posizione T melting dei primers 1 gatcacaggt ctatcaccct attaaccact cacgggagct ctccatgcat ttggtatttt 61 cgtctggggg gtgtgcacgc gatagcattg cgagacgctg gagccggagc accctatgtc 1frw 121 gcagtatctg tctttgattc ctgcctcatt ctattattta tcgcacctac gttcaatatt 2frw 181 acaggcgaac atacctacta aagtgtgtta attaattaat gcttgtagga cataataata 241 acaattgaat gtctgcacag ccgctttcca cacagacatc ataacaaaaa atttccacca 301 aacccccccc tccccccgct tctggccaca gcacttaaac acatctctgc caaaccccaa 361 aaacaaagaa ccctaacacc agcctaacca gatttcaaat tttatcttta ggcggtatgc 421 acttttaaca gtcacccccc aactaacaca ttattttccc ctcccactcc catactacta 481 atctcatcaa tacaaccccc gcccatccta cccagcacac acacaccgct gctaacccca 541 taccccgaac caaccaaacc ccaaagacac cccccacagt ttatgtagct tacctcctca 601 aagcaataca ctgaaaatgt ttagacgggc tcacatcacc ccataaacaa ataggtttgg 661 tcctagcctt tctattagct cttagtaaga ttacacatgc aagcatcccc gttccagtga 721 gttcaccctc taaatcacca cgatcaaaag ggacaagcat caagcacgca gcaatgcagc 2rev 781 tcaaaacgct tagcctagcc acacccccac gggaaacagc agtgattaac ctttagcaat 841 aaacgaaagt ttaactaagc tatactaacc ccagggttgg tcaatttcgt gccagccacc 901 gcggtcacac gattaaccca agtcaataga agccggcgta aagagtgttt tagatcaccc 1rev 961 cctccccaat aaagctaaaa ctcacctgag ttgtaaaaaa ctccagttga cacaaaatag 1021 actacgaaag tggctttaac atatctgaac acacaatagc taagacccaa actgggatta determinare lunghezza posizione T melting dei primers lunghezza ampliconi = da bp n.x a bp n.y e posizione

i controlli essenziali Controlli, negativi, positivi, (i controlli ci fanno capire se l’esperimento è venuto bene) Cosa è il controllo negativo? E quello positivo? A cosa servono? Rischio contaminazione (il DNA templato potrebbe essere presente nell’ambiente dove si esegue l’esperimento) Perché si ha contaminazione ?

procedure a differenza del Northern si può usare quantità minime di RNA la Rev Transcript virale a 37°C, mutanti max 65°C oligo dT, random priming con esanucleotidi, dal cDNA in poi PCR sistemi onnicomprensivi con entrambe le reazioni PCR con primers esonici Primers: le stesse condizioni di scelta di PCR diretta

precauzioni estrarre RNA eliminando DNA genomico che falsifica il risultato cosa si vuole vedere con RT-PCR: la trascrizione di un gene come eliminare il DNA: con estrazioni specifiche con gradiente in ClCs o con solventi specifici (Guanidina) dopo l’estrazione trattamento con DNAse scelta di primers su esoni diversi: il DNA contaminante ha peso molecolare maggiore (introni)

può essere quantitativa? la RT-PCR può essere quantitativa l’amplificazione è proporzionale alla quantità di templato l’amplificazione è proporzionale alla quantità iniziale dopo un certo numero di cicli c’è saturazione saturazione = impossibilità di rilevazione delle differenze o di crescita lineare del prodotto di amplificazione, si perde la proporzionalità di amplificazione e quindi una risposta di tipo quantitativo, resta solo una indicazione qualitativa.

perchè quantitativa ? l’amplificazione è proporzionale al templato iniziale, perchè si conserva la proporzionalità anche dopo molti cicli di amplificazione ? rispondete perchè già lo sapete!

la rivelazione su gel dopo elettroforesi su gel di agarosio si rivela il DNA amplificato come intensità di banda

controllo di RT-PCR altro controllo negativo : assenza di amplificazione sui campioni di RNA non retrotrascritti se si amplifica cosa vuol dire? altro controllo positivo nel caso che il trascritto sia assente o debolissimo: amplificazione con primers per un gene house-keeping

Controlli della PCR Controlli di estrazione: quali? ripetibilità della amplificazione ripetibilità su campioni indipendenti univocità di amplificazione col protocollo ottimizzato Controlli di contaminazione: quali? a. estrazione di controllo con i prodotti di estrazione assenza di amplificazione su a. b. assenza di amplificazione su tutti i prodotti di reazione della PCR: primers taq polimerase nucleotidi tampone acqua di diluizione

R.A.C.E. Con la RT-PCR si amplifica solo un frammento del cDNA Se si vuole identificare l’intero cDNA e non si conosce e si vuole evitare lo :screening” di una “library” si può ricorrere alla RACE Rapid amplification of cDNA ends 5’ or 3’ unknown I) retrotrascrizione fatta con primers random o con poly T quale è la differenza nella scelta di una strategia o dell’altra? se si cerca il 5’ si userà il random priming (esanucleotidi) se si cerca il 3’ si usaerà oligo dT a meno che non si voglia usare un primer specifico anche per la RT mRNA AAAAA 5’ 3’

Principi della RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) La RACE è una tecnica per l’amplificazione di sequenze nucleotidiche, usando come stampo un mRNA tra una ben definita regione interna ad esso ed una sua estremità (3’ o 5’). Questa tecnica, nota anche come “one-sided” PCR o “anchored” PCR, puo’ essere considerata una variante della più classica PCR. La RACE richiede almeno una regione a sequenza nota e interna all’mRNA che si vuole tipizzare. LIMITE PRINCIPALE

Differenze nella ricerca di 5’ o 3’ ignoti AAAAA mRNA oligo esa nucleotidi random 3’ poly TTTTT 5’ cDNA primo filamento prodotto dalla RT (completi e non) 3’ 5’ 3’ TTT 5’ 3’ 5’ I cDNA ottenuti possono avere estremità diverse a secondo dell’efficienza della RT, e dei primers usati

Cerchiamo il 3’ sconosciuto In questo caso si usa un oligo dT per sintetizzare il cDNA -Prima della RT si può effettuare una reazione di DNase per eliminare il DNA genomico che potrebbe dare falsi positivi perché contamina l’ RNA e successivamente il cDNA -Dopo la reazione di RT si può fare una reazione di RNase per eliminare RNA regione nota regione ignota cDNA TTTTT 3’ 5’ RT = reverse transcriptase / trascrittasi inversa

Cosa serve per fare la RACE Un aiuto non indifferente è dato: Dalle banche EST (expressed sequence tags); Da studi di funzione (per esempio EXON e PROMOTER TRAPPING); Dall’IBRIDAZIONE con sequenze conservate evolutivamente e/o funzionalmente.

Race ricerca del 3’ ignoto mRNA 3’ ignoto poly A 3’ TTTTTT 5’ sintesi del I filamento di cDNA con RT con primer oligo dT trattamento con RNase PCR con primer frw. noto e primer rev. con coda aggiunta TTTTTT 5’ 5’ noto 3’ 3’ TTTTTT 3’ ignoto prim rev. 5’ prim.frw

Scelta dei primers per la RACE 3’ Il primo primer obbligato è quello per la RT (poly T) Il secondo primer viene scelto nella regione nota e deve essere specifico regione nota regione ignota cDNA TTTTT 3’ 5’ primer specifico Una amplificazione con un solo primer specifico potrebbe dare dei prodotti anche aspecifici. Quale strategia si può adottare ? Esiste una possibilità per aumentare la specificità di reazione, per ottenere il prodotto specifico corrispondente a ciò che sto cercando ?

RACE 3’ RACE 3’ 1 - Annealing tra la coda di polyA dell’mRNA e un primer contenente una coda di oligo(dT) all’estremità 3’ e retrotrascizione poly(A) tail mRNA 5’ AAA….AAA n TTT…..TTT 5’ 5’ AAA….AAA n 3’ TTT…..TTT 5’ ATTENZIONE!!! Alla facile degradabilità dell’RNA; All’alta probabilità di avere un RNA con strutture secondarie; Alla bassa specificità di questa fase;

Nested PCR o PCR interna regione nota regione ignota cDNA TTTTT 3’ 5’ I primer specifico II primer specifico Il secondo primer specifico dovrà corrispondere ad una regione interna a quella nota e più al 5’ del cDNA e cioè più al 3’ nella regione nota dell’ mRNA (coding sequence) La seconda amplificazione perderà la regione corrispondente al primo primer, si tratta di sequenza già nota e non si perde informazione, probabilità alta di avere un frammento specifico probabilità bassa che due sequenze omologhe siano limitrofe due volte nel genoma. - in casi estremi si può ricorrere ad un terzo primer interno.

un trucco che inganna la polimerasi la polimerase estende da un 3’ libero su un templato 5’ primer 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ la polimerase estende da un 3’ libero purchè appaiato 3’ 5’ poco importa se ha una parte al 5’ non appaiata, verrà inglobata lo stesso nell’amplicone e ne farà parte dalla amplificazione successiva in cui serve da templato

Race fasi successive 2 - Degradazione del templato di RNA TTT…..TTT 5’ 3’ 3 - Amplificazione per PCR usando un primer specifico del gene (GSP) ed uno specifico alla nuova estremità 5’(AUAP o UAP) GSP 3’ TTT…..TTT 5’ UAP …e la specificità??? AUAP gsp = gene specific primer Uap = universal amplification primer Auap = abridget univ.ampl. primer

Specificità GSP2 - SEQUENZIAMENTO DIRETTO; La SPECIFICITA’ può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un secondo primer gene specifico (GSP2) GSP 2 5’ 3’ TTT…..TTT 3’ 5’ UAP - SEQUENZIAMENTO DIRETTO; - CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO; - STUDI FUNZIONALI; AUAP I primers UAP e AUAP servono per avere delle T melting su cui disegnare i GSP

PCR nested RACE 3’ mRNA seq nota AAAA 5’ 3’ cDNA TTTT 3’ 5’ Nel caso di una RACE 3’ cambia solo il verso dei primers interni alla regione nota ed il primer del 3’ ignoto può essere anche un poly T con una coda per avere una T° melting più consona ai primers interni mRNA seq nota AAAA 5’ 3’ RT reverse trascrittasi cDNA I filamento TTTT 3’ 5’ RACE 3’ I filamento TTTT 3’ 5’ II filamento 5’ AAAA 3’ I prim II prim prim esterno con coda eventuale TTTT Solammente il primer della seq nota si può cambiare con un secondo più interno amplicone finale contenente il 3’ ignoto

RACE 5’ Cerchiamo il 5’ ignoto Dobbiamo comunque ottenere il cDNA ed utiliziamo gli stessi metodi utilizzati per ottenere il cDNA della ricerca del 3’ ignoto. C’è anche la possibilità di fare la RT direttamente con un primer noto. L’unico problema è che pochi sono gli enzimi RT che funzionano ad alta temperatura per cui è possibile che il primer specifico non faccia una RT molto specifica. Per questo motivo si tende a fare una RT di tutti i messaggeri (retro-trascrittoma). Dopodichè si deve fare una terminal transferasi come spiegato nelle diapositive successive, si preparano dei primers con una coda che possono aumentare l’efficienza rispetto al primer poly C. Si devono usare invece i primers interni specifici nested in maniera simile alla RACE 3’.

Race 5’ fase I 1 - Annealing tra una regione interna dell’mRNA e un primer gene specifico (GSP1); oppure con poly T o random priming (esanucleotidi random). poly(A) tail mRNA 5’ AAA….AAA n GSP1 GSP1 NON deve essere interno o sovrapposto ad introni; NON deve avere una Tm molto alta (lavora circa a 42°C); NON deve avere una bassa specificità o omologia con altri geni;

Race 5’ fase II 2 - Retrotrascrizione e tailing all’estremità 3’ del cDNA 5’ AAA….AAA n 5’ 3’ GSP1 3’ 5’ Degradazione mRNA GSP1 Purificazione del cDNA 3’ 5’ CCC….CCC GSP1

Race 5’ fase III 3 - Amplificazione per PCR usando un secondo primer specifico al gene (GSP2) ed uno contenente una coda di oligo(dC) all’estremità 3’ 3’ 5’ GSP1 CCC….CCC GIG…..GGI GSP2 La SPECIFICITA’ può essere garantita da un ulteriore amplificazione con un altro primer gene specifico (GSP2) GSP2 GSP3 5’ 3’ CCC….CCC GIG….GGI UAP AUAP I inosina

race 5’ignoto riepilogo mRNA poly A Sintesi del I filamento di cDNA tramite rev.transcript. 5’ 3’ primer rev. specifico rev. transcript. a temp. restrittiva con enzima mutante RH- 5’ 3’ 3’ cDNA singolo filamento 5’ trattamento con RNase c c c trattamento con terminal transferase c c c c c c c CCCC 5’ 3’ cDNA singolo filamento primer frw di poly G sintesi secondo filamento CCCC 5’ PCR selettiva 3’ cDNA singolo filamento primer rev. specif.

Race 5’ ricapitolazione dopo la sintesi del I filam. di cDNA e la terminal transferase, PCR selettiva con II primer rev. selettivo interno 5’ 3’ CCCC 3’ 5’ II primer rev. spec. interno (nested) I primer rev. specif. GGGGG 5’ sconosciuto CCCCCC II primer rev. spec. interno (nested) Clonaggio in un vettore per inserzione con estremita’ coesive per restrizione dell’adattatore o con A-T

Clonaggio dei prodotti PCR Clonaggio in plasmidi dedicati con prodotti PCR con TAQ polymerase w.t. si hanno aggiunte di A terminali spuri TAQ proof reading o altri producono ampliconi “blunt ends” Secondo che enzima si usa, si sceglie un plasmide adeguato. Esistono in vendita: - plasmidi gia’ linearizzati con coda di T terminale per facilitare la ligasi tra l’amplicone ed il plasmide - plasmidi con topoisomerasi coniugata all’estremita’ del plasmide che attacca direttamente l’amplicone senza bisogno di ligasi