La cellula e i suoi componenti: Tecniche di visualizzazione Fluorescence image of actin in yeast EM image of yeast DIC image of yeast cell

implicano la morte e/o rottura cellulare. Tecniche di visualizzazione invasive: implicano la morte e/o rottura cellulare. Yeast cell ElettroMicroscopia : permette di studiare la struttura della cellula Attenzione agli artefatti del fissaggio!!!

Tomografia Permette di visualizzare strutture intracellulari e di averne una immagine tridimensionale

Microscopia ottica Tecniche non invasive:permettono lo studio delle cellule vive e quindi sono utilizzate per lo studio della dinamica dei processi Yeast cells DIC image Nel microscopio ottico a campo chiaro la luce della sorgente di illuminazione converge sul preparato attraverso il condensatore. I campioni analizzati attraverso il microscopio a campo chiaro vengono spesso colorati, poichè il basso contrasto rende il campione poco visibile.

Microscopia a contrasto di fase Microscopio a contrasto di fase si basa sull'incremento delle differenze di contrasto tra il campione da analizzare e il mezzo circostante, in modo tale da consentirne la visualizzazione senza ricorrere a metodologie di colorazione. Il principio alla base di questo tipo di microscopia è che il campione, per esempio un preparato di cellule, ha un indice di rifrazione differente dal mezzo circostante e quando la luce lo attraversa viene deviata e ritardata. L'obiettivo del microscopio a contrasto di fase amplifica questo effetto e porta alla formazione di una immagine scura su campo chiaro. indice di rifrazione:     Parametro che rappresenta il fattore numerico per cui la velocità di propagazione di una radiazione elettromagnetica viene rallentata, rispetto alla sua velocità nel vuoto, quando questa attraversa un materiale.

Proteine fluorescenti Che cosa è la fluorescenza esattamente? L’energia assorbita eccita gli elettroni nel fluoroforo a uno stato energetico più elevato. Questi vibrando e ruotando perdono parte dell’energia acquisita, il resto è restituita come luce fluorescente quando gli elettroni ritornano allo stato quiescente Cellule HeLa che esprimono GFP Il fenomeno della fluorescenza è stato descritto per la prima volta da Sir. George Stroke Le molecole fluorescenti agiscono come fonte di luce localizzata nell’area specifica in cui viene emessa la fluorescenza

Green Fluorescent Protein (GFP) Struttura Che cosa è la fluorescenza esattamente? L’energia assorbita eccita gli elettroni nel fluoroforo a uno stato energetico più elevato. Questi vibrando e ruotando perdono parte dell’energia acquisita, il resto è restituita come luce fluorescente quando gli elettroni ritornano allo stato quiescente http://www-bioc.rice.edu/Bioch/Phillips/Papers/gfpbio.html Fluoroforo di GFP: Ser65-Tyr66-Gly67 It is very resistant to denaturation requiring treatment with 6 M guanidine hydrochloride at 90 C or pH of <4.0 or >12.0. Partial to near total renaturation occurs within minutes following reversal of denaturing conditions by dialysis or neutralization.

del fluoroforo così come dalla localizzata interazione Images from http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/GFP.html Le proprietà spettrali delle proteine fluorescenti sono dipendenti dalla struttura del fluoroforo così come dalla localizzata interazione dei residui aminoacidici nelle immediate vicinanze, e in alcunicasi , dei residui lontani dal fluoroforo

Sorgente luminosa Shift di STROKE L’energia di una fonte luminosa viene catturata dal fluoroforo della proteina fluorescente e viene riemessa ad una lunghezza d’onda maggiore Ogni fluoroforo ha una lunghezza d’onda di eccitazione e di emissione specifica La variazione di lunghezza d’onda assorbita ed emessa si chiama Shift di Stroke

Video microscopia: studio della dinamica delle proteine in vivo Wagner et al.,2002 Time lapse:4 focal plane 0.2 micron apart x image Visualizzazione dell’anello actomiosinico durante a contrazione con l’utilizzo di proteine fuse a GFP wt+Myo1GFP Myo1GFP

Microscopia confocale Mlc1p-YFP Sec2p-CFP Immagine microscopia epifluorescente

High throughput / High content microscopy Nuove tecnologie: High throughput / High content microscopy Microscopia ottica:

The cell is identified by the software using DAPI intensity within the nuclei

Metodi di rottura delle cellule Metodi meccanici : 1.Omogenizzatori 2.Frantumazione con abrasivi 3.Presse 4.Sonicazione Metodi enzimatici: Lisozima (batteri), Zimoliasi, Liticasi (lieviti) Chitinasi (funghi filamentosi)

Metodi meccanici : 1.Prodotto non omogenizzato 2.Prodotto non 1. omogenizzatori 1.Prodotto non omogenizzato 2.Prodotto non 1a. Omogenizzatori a pestello: adatto per cellule animali e tessuti vegetali non va bene per cellule di microorganismi. -Il tessuto viene messo in un provettone di vetro all'interno del quale agisce un pestello di vetro o di metallo -Il tessuto è forzato a passare tra le pareti della provetta, che viene mantenuta ferma, e il pistone mobile che ruota.. Le forze frizionali che si svilupperanno dipenderanno anche dalla velocità di rotazione del pestello sono maggiori alla superficie del pestello e minori vicini alle pareti dela provetta..

Microscopia a contrasto di fase             prima (1) durante (2) dopo (3) Cellule di lievito visualizzate tramite microscopia a contrasto di fase: DIC image: Al punto di fuoco i raggi di luce convergente mostrano un interferenza che si traduce in un aumento o diminuzione dell’ampiezza dell’onda risultante percepita dall’occhio come una differenza di luminosità

1b. Omogenizzazione con palline di vetro: per lieviti e batteri Rottura meccanica delle cellule con GLASS BEADS Figure 1. Negative control yeast without glass beads.             Figure 3. Yeast disrupted for 10 min. with 425-600 mesh glass beads. Figure 2 Yeast disrupted for 5 min. with 425-600 mesh glass beads. prima (1) durante (2) dopo (3) Cellule di lievito visualizzate tramite microscopia a contrasto di fase:

segue….Metodi meccanici : 2. Frantumazione con abrasivi: Sospensioni di cellule vegetali e batteriche. Le cellule vengono disgregate dall’abrasivo Si può effettuare a mano con un pestello in un mortaio in presenza di allumina o sabbia e tampone. 3. French Press:: Adatta cellule microbiche La rottura avviene a causa di forze taglienti French Press: La sospensione cellulare viene posta all'interno di una camera di acciao inox, collegata con l'esterno per mezzo di una valvola a spillo. All'inizio della procedura questa valvola viene mantenuta chiusa. La camera viene quindi capovolta, la valvola viene aperta, e mediante un pistone si fa fuoriuscire l'aria contenuta all'interno della camera. La valvola viene di nuovo chiusa e mediante il pistone si esercita una pressione all'interno della camera. Raggiunta la pressione desiderata, si riapre lentamente la valvola a spillo, le cellule per effetto della diminuzione della pressione, si espandono e scoppiano. Mantenendo la valvola aperta è possibile raccogliere l'omogenato.

Questo metodo determina un elevato sviluppo di calore, 4. ultrasuoni: Viene utilizzato per piccole preparazioni di cellule di microorganismi. le cellule vengono introdotte in una camera dove vengono generate onde sonore ad alta frequenza (maggiori di 20kHz) per tempi variabili (30-60 secondi). Queste onde generano ondate pressorie elevate che rompono le cellule tramite forze taglienti e cavitazionali. Le bolle di gas presenti nel mezzo inizialmente sono sotto pressione ma quando si decomprimono si producono onde d’urto che causano la rottura cellulare . Questo metodo determina un elevato sviluppo di calore, è quindi preferibile operare mantenendo il campione in ghiaccio.

la lisi cellulare va effettuata in Perché la lisi cellulare va effettuata in Tamponi di lisi ? I processi biologici richiedono un pH ottimale Il pH ottimale per un dato enzima sarà il pH del compartimento cellulare in cui l’enzima lavora : Es. citoplasma pH =neutro, Lisosomi pH=5, succhi gastrici pH=1 Gli studi in vitro dei processi metabolici devono quindi considerare il pH ottimale del processo enzimatico o cellulare da studiare

Gli elettroliti che reagiscono con l’H2O e aumentano pH e Soluzioni tampone Gli elettroliti che reagiscono con l’H2O e aumentano la quantità di OH- sono BASI, mentre gli acidi aumentano la quantità di H+ una soluzione tampone e’ una soluzione salina che permette di mantenere il pH della soluzione inalterato anche in presenza di basi o acidi aggiunti…. naturalmente entro certi limiti!!! (capacità tamponante)

resiste alle variazioni di concentrazione Una soluzione tampone resiste alle variazioni di concentrazione degli ioni H+ in seguito all’aggiunta di acidi o basi La capacità tamponante  = db / d(pH) db= db = quantità di base aggiunta d(pH)= aumento del valore del pH risultante dall’aggiunta della base La capacità tamponante sarà massima quando pH=pKa Ed ad alta concentrazione del tampone Nella pratica le soluzioni tampone sono costituite da una miscela di acido o base debole e dal loro sale Es. acido acetico e sodio acetato

Tamponi di estrazione: COSA CONTENGONO? Soluzioni tampone comunemente usate Tris-HCl, K-fosfato con forze ioniche tra 0.1 e 0.3 M e un pH tra 7 e 8 Tamponi di estrazione: COSA CONTENGONO?

Che cos’altro contengono i tamponi di lisi ? 1.Antiossidanti: DTT, b-mercaptoetanolo, cisteina o glutatione ridotto. La cellula ha un ambiente riducente ma dopo rottura le proteine si trovano esposte ad un ambiente ossidante SH- HS ossidazione S- S 2.Substrati enzimatici e cofattori 3.Agenti chelanti ioni divalenti:EDTA, EGTA 4.Sodio azide

Inibitori degli enzimi. Inibitori di serin proteasi: PMSF (fenilmetil sulfonilfluoro). DFP (di-isopropilfosfofluoruro), TPCK (Tosilfenilalanil-clorometilchetone) 2) Inibitori dell’ tiolo proteasi: iodoacetato ; cistatina. 3) Inibitore dell’ aspartico proteasi : pepstatina. 4) Inibitori delle metalloproteasi: EDTA ; 1,10-fenantrolina 5) Inibitori della esopeptidasi: Amastatina; Bestatina

METODI DI Estrazione delle proteine

SDS, sodio deossicolato, Triton X-100 e Nonoident P-40 DETERGENTI Si usano per solubilizzare proteine intrinseche di membrana Ionici: SDS, sodio deossicolato, CTAB e CHAPS Non – ionici: Triton X-100 e Nonoident P-40

Integrali e transmembrana Proteine di membrana: Integrali e transmembrana Image from : http://en.wikipedia.org/wiki/Membrane_protein Richiedono detergenti o solventi non-polari per l’estrazione, sebbene alcune di loro (beta-barrels) possono essere estratte usando agenti denaturanti.

Post-traduzionali che aggiungono code lipidiche Proteine periferiche di membrana Membrana Image from :http://en.wikipedia.org/wiki/Membrane_protein Le proteine periferiche di membrana sono temporaneamente attaccate alla membrana lipidica o a proteine integrali di membrana tramite una combinazione di legami idrofobici, elettrostatici e altre interazioni non covalenti Proteine solubili possono associarsi reversibilmente o permanentemente a membrane grazie a modificazioni Post-traduzionali che aggiungono code lipidiche (es: prenili o GPI=glycosylphosphatidylinositol)

di estrazione di proteine associate alle membrana Esempio di estrazione di proteine associate alle membrana Le proteine intrinseche di membrana si solubilizzano con detergenti Quelle periferiche di membrana dissociano a seguito di un trattamento con reagenti polari, come soluzioni che possiedono un elevato pH o alte concentrazioni saline