Laboratorio Multidisciplinare Modulo di Microbiologia UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PALERMO Facoltà di Scienze MM. FF. NN. Corso di Laurea in Scienze Biologiche anno accademico 2008-2009 Laboratorio Multidisciplinare Modulo di Microbiologia C.M. Maida Dip. Scienze per la Promozione della Salute Facoltà di Medicina e Chirurgia

I batteri differiscono per morfologia (dimensione, forma e caratteristiche di colorazione), caratteristiche metaboliche, antigeniche e genetiche. Benchè sia difficile differenziare i batteri in base alle dimensioni, è facile distinguerli in base alla forma.

microscopia ottica

microscopia elettronica

Una cellula batterica risulta formata da diverse componenti citoplasmatiche ed esterne. GENOMA CITOPLASMA MEMBRANA CITOPLASMATICA PARETE BATTERICA FLAGELLI CAPSULA PILI SPORE

PARETE CELLULARE Una caratteristica della cellula batterica è quella di essere racchiusa in un contenitore rigido che ne condiziona la forma e ne conferisce rigidità strutturale. In base alle caratteristiche morfologiche e strutturali della parete cellulare i batteri vengono distinti in Gram positivi e Gram negativi. Solamente i micobatteri non possono essere colorati con il metodo di Gram perché possiedono una parete differente.

Il componente fondamentale della parete è un enorme polimero chiamato PEPTIDOGLICANO, formato dalla ripetizione di un’unità strutturale assolutamente peculiare della cellula procariota.

Mycobacterium cell wall

GRAM POSITIVI Un batterio Gram positivo ha una parete spessa e multistratificata formata principalmente da peptidoglicano che circonda la membrana citoplasmatica. La parete dei Gram + può includere anche altri componenti come acidi teicoici (legati covalentemente al peptidoglicano), lipoteicoici (legati alla membrana citoplasmatica) e polisaccaridi complessi. Gli acidi teicoici sono fattori di virulenza.

GRAM NEGATIVI Strutturalmente presentano: - un sottile strato di peptidoglicano - una membrana esterna chiamata LPS (endotossina) Non sono presenti acidi teicoici ne lipoteicoici. Tra i due rivestimenti è presente uno spazio chiamato PERISPLASMATICO.

Attivazione del complemento L’endotossina (Lipide A) svolge la sua azione patogena attraverso i seguenti meccanismi: Attivazione del complemento Attivazione dei macrofagi Induzione di interferone Induzione di interleuchine Attivazione dei granulociti Pirogenicità

Gram + Gram -

Gram - Gram +

COLORAZIONE DI GRAM I batteri reagiscono in maniera differente alla colorazione di Gram, in base alla diversa permeabilità degli involucri cellulari (a causa di una differente morfologia e composizione) che è maggiore nei Gram – e minore nei Gram +. I batteri Gram + non rilasciano il colorante primario se trattati con alcool, mentre i batteri Gram – si decolorano facilmente. Si fonda sulla proprietà che ha il cristalvioletto di combinarsi con lo iodio dando composti non dissociabili con l’alcool.

modalità di esecuzione: I batteri Gram + conservano la colorazione blu del cristalvioletto; i batteri Gram - vengono prima decolorati con l’alcool e poi ricolorati con la safranina. modalità di esecuzione: distensione della sospensione fissazione al calore su un vetrino colorazione con cristal-violetto precipitazione con iodio-ioduro di potassio decolorazione con alcool colorazione con safranina

Gram + Gram -

Gram - Gram +

Gram - Coltura mista Coltura mista Gram +

ESAME COLTURALE Lo sviluppo della batteriologia ebbe inizio solo quando fu trovata la possibilità di coltivare i batteri nei terreni di coltura. TERRENO DI COLTURA: substrato artificiale costituito da sostanze più o meno complesse capace di mantenere la vitalità e di permettere la riproduzione dei batteri fuori dal loro “habitat” naturale. La crescita batterica si verifica nei terreni di coltura dopo un certo periodo di tempo, detto “periodo d’incubazione” (24-48 ore); durante questo periodo è necessario che le colture siano tenute a temperatura ottimale.

CASSIFICAZIONE DEI TERRENI In base allo stato: LIQUIDI SEMISOLIDI SOLIDI In base alla complessità SEMPLICI A COMPOSIZIONE DEFINITA COMPLESSI In base alle proprietà selettive o differenziali NON SELETTIVI SELETTIVI DIFFERENZIALI

I terreni liquidi di uso comune sono: In base allo stato – I TERRENI LIQUIDI Furono i primi terreni di coltura usati in batteriologia. Vengono utilizzati per la coltivazione dei batteri. I terreni liquidi di uso comune sono: brodo nutritivo – si ottiene dalla infusione a temperatura ambiente della carne di bue privato del grasso, delle aponevrosi, dei tendini; acqua peptonata – si ottiene dallo scioglimento di peptone 1% e di cloruro di sodio 0,5% in acqua distillata.

In base allo stato – I TERRENI SEMISOLIDI

In base allo stato – I TERRENI SOLIDI Agar triptosio Agar sangue Agar cioccolato Baird parker Mac Conkey Mac Conkey

FONDAMENTI DELLA CONTA MICROBICA I batteri, seminati in une terreni solido agarizzato ed incubati in termostato, si riproducono formando ammassi rotondeggianti, eventualmente pigmentati, dette colonia. Ogni colonia origina da una singola cellula batterica (in genere diventano visibili dopo almeno 18 ore di incubazione, quando si raggiunge una carica di almeno 1.000.000 cellule) Ogni batterio, crescendo, si divide e produce una singola colonia; L’inoculo originale è omogeneo; Non sono seminati aggregati cellulari

1 / fattore di diluizione 1590 (CFU / ml) x 103 = 1,59 x 106 CFU/ml 0,1 ml 159 (CFU) : 0,1 (ml) = 1590 (CFU / ml)

1 / fattore di diluizione 2,03 x 103 (CFU / ml) x = 104 2,03 x 107 CFU / ml 0,1 ml 203 203 (CFU) : 0,1 (ml) = 2030 (CFU / ml) = 2,03 x 103 (CFU / ml)

70 (CFU) : (ml) = (CFU / ml) = x102 (CFU / ml) 0,5 140 1,4 1 / fattore di diluizione 1,4 x 102 (CFU / ml) x = 104 1,4 x 106 CFU / ml 0,5 ml 70 70 (CFU) : (ml) = (CFU / ml) = x102 (CFU / ml) 0,5 140 1,4

1,5 x 105 CFU / ml 1 ml 15 1,5 x 104 CFU / ml 1,5 x 103 CFU / ml

1,5 x 105 CFU / ml 1 ml 1,5 x 105 CFU / ml 1 o 2 colonie

Inoculazione Interpretazione

20 mm