OLVIVA QUALIFICAZIONE DEL VIVAISMO OLIVICOLO: ISTITUTO DI GENETICA VEGETALE, PERUGIA Luciana Baldoni OLVIVA QUALIFICAZIONE DEL VIVAISMO OLIVICOLO: CARATTERIZZAZIONE VARIETALE, SANITARIA E INNOVAZIONI NELLA TECNICA VIVAISTICA AZIONE 1: 'Caratterizzazione molecolare e morfologica' LOCOROTONDO, 6 Luglio 2006

Il patrimonio genetico dell'olivo in Italia AZIONE 1 Il patrimonio genetico dell'olivo in Italia L’olivo annovera il germoplasma più ricco tra tutte le specie coltivate   Le cultivar italiane ufficialmente censite sono 395 (schedario olivicolo suppl. G.U. 5/94) Quelle riportate da Bartolini et al. (1998) sono 538, pari al 42% del patrimonio varietale mondiale Tuttavia il numero di cultivar di interesse ai fini produttivi e quindi oggetto di moltiplicazione e commercio di piante sul mercato nazionale e mondiale è circoscritto ad alcune decine

Le norme per la commercializzazone del materiale di propagazione Il materiale vegetale d’olivo deve soddisfare i requisiti sanitari e genetici imposti dalle direttive UE sulle condizioni minime per la commercializzazione dei materiali di moltiplicazione (Conformitas Agraria Communitatis-CAC, Dir. n. 92/34 del 28 aprile 1992, e Dir. n. 93/48 del 23 giugno 1993). A tal fine occorre disporre di strumenti in grado di identificare e certificare il genotipo. L’impiego di tecnologie di analisi molecolare ha dimostrato di poter stabilire il livello di variabilità intervarietale e di caratterizzare le cultivar esaminate.

Il Progetto OLVIVA si propone di: AZIONE 1 Il Progetto OLVIVA si propone di: Sviluppare tecnologie biomolecolari in grado di stabilire con certezza l’identità delle varietà di maggiore interesse per l’olivicoltura e il vivaismo delle Regioni coinvolte nel Progetto* Risolvere i casi di sinonimia Fornire strumenti analitici per la certificazione genetica del materiale di propagazione. *Liguria, Toscana, Umbria, Marche, Lazio, Campania, Molise, Basilicata, Puglia, Calabria, Sicilia, Sardegna

Le cause della confusione sulla consistenza e distribuzione AZIONE 1 Le cause della confusione sulla consistenza e distribuzione del patrimonio varietale Varietà locali Varietà cosmopolite Varietà migranti Confusione dovuta a casi di: sinonimia (Frantoio-Raggiola, ecc.) omonimia (Ogliarola, Dolce, ecc.) toponimia (Cellina di Nardo', Rosciola di Rotello, ecc.) morfonimia (Pendolino, Tonda, ecc.) Cultivar, Ecotipi locali, Genotipi rari, Selvatici Cloni? Popolazioni varietali?

Perche' e' necessaria la caratterizzazione molecolare Le tecniche biomolecolari, svincolate dalle condizioni ambientali, dall'età dell'albero e dal tessuto prelevato, rappresentano oggi il mezzo più potente di caratterizzazione varietale. Attraverso le tecniche di identificazione biomolecolare sarà possibile associare a ciascuna varietà un codice numerico identificativo. Le informazioni derivanti dal progetto troveranno utili applicazioni per la certificazione del materiale vivaistico, per la rintracciabilità della composizione varietale degli oli monovarietali, DOP, e IGP e per la tutela del germoplasma locale.

AZIONE 1 Obiettivi Caratterizzazione e genotipizzazione molecolare e morfologica delle principali varietà di olivo di interesse produttivo e vivaistico per le Regioni coinvolte nel Programma Identificazione delle relazioni genetiche tra le varietà delle diverse Regioni e soluzione dei casi di sinonimia e omonimia Sviluppo di una piattaforma diagnostica per il riconoscimento rapido dell’identità delle varietà di olivo più importanti Certificazione variatale di piante madri e materiale vivaistico destinato al commercio

Stato dell’arte della ricerca AZIONE 1 Stato dell’arte della ricerca Nonostante la disponibilità di strumenti efficacissimi e l’impegno di numerosi laboratori, la caratterizzazione delle varietà italiane ha sofferto del mancato coordinamento tra i diversi gruppi, comportando: l’impossibilità di comparazione tra i dati ottenuti, casi di duplicazione di lavori mancanza di informazioni su varietà molto importanti.

Identificazione varietale Impiego di un set COMUNE comune di marcatori molecolari Impiego di un set COMUNE di caratteri morfologici e fenologici

Marcatori microsatellitari (SSR) AZIONE 1 Marcatori microsatellitari (SSR) Tra i marcatori disponibili in letteratura si ritiene che i microsatelliti (o SSR, Simple Sequence Repeats) siano i più rispondenti per le finalità perseguite dal Progetto. Per l’identificazione varietale gli SSR rappresentano, in questo momento, i marcatori più affidabili e altamente ripetibili, oltre che facili da applicare. Diversi gruppi hanno già selezionato in olivo alcune decine di microsatelliti particolarmente polimorfici e informativi (Carriero et al., 2002; Cipriani et al., 2002; Sefc et al., 2000). Alcuni di questi microsatelliti sono stati testati per la caratterizzazione di alcune varietà di olivo (Bandelj et al., 2002; Belaj et al., 2004), per la costruzione di mappe genomiche e studi di paternità (de la Rosa et al., 2003; de la Rosa et al., 2004), per l’analisi di relazioni tra specie affini (Rallo et al., 2003) e per la rintracciabilità degli oli di oliva (Pasqualone et al., 2004; Testolin e Lain, 2005).

Un primo set di SSR proposto AZIONE 1 Un primo set di SSR proposto Scegliere un set di circa 20 SSR In linea di massima viene indicato l’elenco dei potenziali marker SSR utilizzabili: Locus DCA-17 UDO-43 DCA-18 DCA-09 GAPU-103 GAPU-89 EMO-90 GAPU-71B DCA-04 DCA-16 DCA-14 DCA-15 DCA-05 UDO-09 DCA-13 GAPU-45 DCA-07 EMO-13 GAPU-71A UDO-39

AZIONE 1 Proposta di un protocollo comune per lo sviluppo di un set di marcatori molecolari utili alla definizione, caratterizzazione ed identificazione delle varietà di olivo italiane. Costituzione di una rete di laboratori; Raccolta e catalogazione dei dati molecolari disponibili su germoplasma coltivato e spontaneo; Sviluppo di una piattaforma diagnostica per il riconoscimento rapido dell’identità delle varietà di olivo più importanti; Realizzazione e gestione di un data-base comune.

Azioni necessarie AZIONE 1 Screening, su un numero ristretto (circa 20) di cultivar, di SSR previamente identificati in olivo per selezionare un set di 15-20 SSR, sulla base dell’efficienza di discriminazione (numero di alleli, grado di eterozigosi, numero di loci, ecc.); Selezione di 20-25 SNP previamente identificati e verifica della loro applicabilità alla caratterizzazione varietale (locus singolo, grado di eterozigosi, ecc.); Sviluppo di protocolli per la comparazione dei dati ottenuti da laboratori diversi, uso di varietà comuni come marker di riferimento (Frantoio? Picual?), ring test, ecc.); Validazione dell’identità genetica delle varietà presenti nelle collezioni ufficiali mediante analisi comparata; Determinazione della variabilità intra-varietale (tra cloni) mediante analisi molecolari supplementari; Costituzione di una banca dati contenente le informazioni bio-molecolari, fenologiche ed agronomiche delle varietà di olivo che rappresenti uno strumento di consultazione per la descrizione varietale, anche ai fini della certificazione genetica del materiale vegetale.

1.1 Caratterizzazione molecolare Scelta di 200 varietà da sottoporre ad analisi; Raccolta dei campioni da fonte qualificata; Distribuzione ai diversi laboratori ed estrazione del DNA; Analisi molecolare di tutti i campioni mediante un set di circa 20 marcatori microsatellitari; Validazione dei risultati mediante verifica del grado di ripetibilità del metodo molecolare adottato con ring-test tra i laboratori partecipanti; Analisi dell’efficacia discriminante dei marcatori usati, del grado di similarità genetica fra le cultivar e valutazione della presenza di eventuali casi di sinonimia ed omonimia; Assemblaggio dei profili molecolari, parametri morfologici e agronomici salienti e definizione di una ‘carta d’identità’ varietale; Creazione di un database mediante trasferimento su supporto informatico di tutte le informazioni derivate dal Progetto.

1.2 Definizione di un protocollo comune AZIONE 1 1.2 Definizione di un protocollo comune per la caratterizzazione morfologica delle varietà di olivo Raccolta del materiale vegetale (foglie, frutti, fiori, ecc.) dalle stesse piante di cui al punto precedente. Analisi dei parametri morfologici più discriminanti. Assemblaggio dei profili molecolari, parametri morfologici e agronomici salienti e definizione di una ‘carta d’identità’ varietale per descrivere ciascuna cultivar sul piano genetico e fenotipico Creazione di un database mediante trasferimento su supporto informatico di tutte le informazioni derivate dal Progetto da rendere disponibili alla comunità scientifica e al mondo produttivo tramite la realizzazione di un sito Web dedicato.

PIANO TEMPORALE DELLE ATTIVITÀ AZIONE 1 PIANO TEMPORALE DELLE ATTIVITÀ I ANNO Scelta delle varietà. Raccolta dei campioni per analisi molecolare. Estrazione del DNA. Raccolta del materiale vegetale. Valutazione delle reazioni all’inoculazione artificiale di Verticillium dahliae. II ANNO Analisi molecolare. Analisi dell’efficacia discriminante dei marcatori. Analisi della similarità fra cultivar. Analisi dei parametri morfologici. Valutazione della resistenza alla malattia. III ANNO Validazione dei risultati. Realizzazione carta di identità varietale. Selezione di piante di olivo dotate di elevata resistenza a V. dahliae Realizzazione database.

Quali sono i partner coinvolti? AZIONE 1 Quali sono i partner coinvolti?

AZIONE 1 Scelta delle varietà da caratterizzare (fase comune a tutte le azioni) La definizione del numero di varietà su cui sviluppare le attività del progetto si è basata sui seguenti parametri: Numero di varietà richieste dal bando Produzione oleicola media delle Regioni interessate dall’intervento Numero di varietà riportate in letteratura per ciascuna varietà

Protocollo comune per la caratterizzazione morfologica Raccolta del materiale (foglie, frutti, fiori, ecc.) dalle stesse piante impiegate per la caratterizzazione molecolare. Analisi dei parametri morfologici più discriminanti: verranno inclusi quelli usati per il Catalogo Mondiale delle Varietà di Olivo (COI, 2000): Foglia (lunghezza-larghezza-forma-curvatura); Infiorescenza (lunghezza-numero fiori/infiorescenza); Frutto (peso-forma-simmetria-diametro-posizione apice-posizione base-umbone- numero e dimensioni delle lenticelle); Endocarpo (peso-forma-simmetria-superficie-numero solchi fibrovascolari-terminazione apice). Messa a punto della tecnologia di acquisizione di immagini digitalizzata e l’analisi computerizzata dei parametri morfometrici. Tale caratterizzazione sarà condotta di concerto con le UO che si occupano della caratterizzazione molecolare delle varietà di olivo. Particolare interesse rivestono le informazioni sugli aspetti di biologia fiorale e di fruttificazione, maturazione dei frutti, fasi fenologiche, qualità dell’olio, capacità rizogena delle talee, suscettibilità ad avversità biotiche ed abiotiche.

Definizione di una ‘carta d’identità’ varietale AZIONE 1 Definizione di una ‘carta d’identità’ varietale Realizzazione di un database con tutte le informazioni disponibili Profili molecolari e parametri morfologici e fenologici salienti verranno assemblati e organizzati al fine di descrivere ciascuna cultivar sul piano genetico e fenotipico. Tutte le informazioni derivate dal Progetto verranno trasferite su supporto informatico e rese disponibili alla comunità scientifica e al mondo produttivo tramite la realizzazione di un sito Web dedicato.

Risultati previsti AZIONE 1 Individuazione di genotipi e varietà che manifestano una forte potenzialita' per il recupero e la valorizzazione nelle aree olivicole delle Regioni interessate dall’intervento; Realizzazione di una banca dati di cultivar di olivo caratterizzate con marcatori molecolari in grado di soddisfare i requisiti di identità varietale richiesti dai disciplinari di produzione del materiale vivaistico certificato e quelli di garanzia di qualità dei prodotti D.O.P; Verifica delle caratteristiche di resistenza alla verticilliosi di ecotipi locali, varietà commerciali e portainnesti; Definizione di un metodo di fingerprinting adottabile a livello nazionale per identificare in modo univoco l’appartenenza di un genotipo ad una determinata varietà; Disponibilità di un numero definito e comune di descrittori morfologici stabili per tutte le cultivar analizzate; Chiarimento dei casi di sinonimia ed omonimia; Realizzazione di una carta di identità varietale per il materiale oggetto delle attività; Definizione di procedure univoche per i controlli di certificazione varietale. Sviluppo di una mappa genetica di popolazioni ottenute da programmi di miglioramento genetico.

AZIONE 1 Prodotti Rilascio di un set di marcatori molecolari in grado di distinguere le varietà di olivo di maggiore interesse commerciale. Dati molecolari validati in grado di produrre un ‘passaporto’ per ciascuna varietà. Caratterizzazione molecolare, morfologica, fenologica ed agronomica delle varietà di maggiore interesse. Banca dati molecolare. Sviluppo di una piattaforma tecnologica avanzata per la certificazione genetica del materiale vivaistico. Schede di caratterizzazione varietale/clonale, approntate secondo quanto previsto nel disciplinare di certificazione del materiale di propagazione, per il riconoscimento delle Fonti Primarie caratterizzate nel Sistema Nazionale di Certificazione. Sito disponibile world-wide-web con tutte le informazioni relative alle più importanti varietà per i vivaisti, gli operatori del settore olivicolo-oleario e i ricercatori.