AA 2011/2012 Lezioni 21-22 Vaccini Adriana Maggi DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2011/2012 Lezioni 21-22 Vaccini

1. immunità aspecifica o innata 2. immunità specifica o adattativa SISTEMA IMMUNITARIO 1. immunità aspecifica o innata 2. immunità specifica o adattativa

IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA Difese fisiche pelle muco mucose Difese chimiche/umorali Enzimi (eg secrezioni esocrine quali saliva, lacrime ecc.) Mediatori infiammazione Complemento Difese cellulari Fagociti( macrofagi, neutrofili e cellule dendritiche) mast cell, eosinofili, basofili e cellule natural killer

IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA Caratteristiche fondamentali capacità di rispondere ad un vasto numero di agenti patogeni grazie al riconoscimento di un limitato numero di profili molecolari non-self estremamente diffusi in natura (come LPS, glicani ricchi in mannosio, RNA a doppia elica, ecc.). La rapidità di risposta dovuta a meccanismi di riconoscimento presenti uniformemente su tutti i componenti dell’immunità aspecifica e sono completamente determinati a livello genetico senza alcun bisogno di processi maturativi di tipo epigenetico (cfr. immunità specifica).

IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA- Limiti efficacia non sempre ottimale l’incapacità di adattarsi alle contromisure sviluppate dai microrganismi patogeni una scarsa capacità di discriminazione tra self e non-self, che determina lo sviluppo di danni tessutali spesso sproporzionati rispetto all’entità dello stimolo immunogeno (infezione).

IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA- Limiti efficacia non sempre ottimale incapacità di adattarsi alle contromisure sviluppate dai microrganismi patogeni scarsa capacità di discriminazione tra self e non-self, che determina lo sviluppo di danni tessutali spesso sproporzionati rispetto all’entità dello stimolo immunogeno (infezione). Microscopia elettronica di un neutrofilo che ingloba un batterio di antrace

apprendimento – memoria - adattabilità IMMUNITA’ ACQUISITA Immunità umorale: generazione di anticorpi efficace quando il patogeno è nel tessuto ma non si è stabilito nelle singole cellule Immunità cellulo mediata: cellule citotossiche efficace per i virus ed altri patogeni localizzati a livello intracellulare l’immunità specifica ha la capacità di adattarsi variabilità di agenti ambientali riconosciuti come un pericolo per l’organismo. Si calcola che tutte le possibili combinazioni molecolari presenti in natura e in grado di interagire con l’organismo si aggiri intorno a 1010 apprendimento – memoria - adattabilità

IMMUNITA’ ACQUISITA Immunità umorale: anticorpi che sono prodotti dalle plasmacellule derivate dai linfociti B. Il linfocita rileva un agente esterno grazie al suo recettore specifico e inizia la produzione di cellule clone che in parte saranno destinate alla memoria immunologica e in parte andranno a formare le plasmacellule. le plasmacellule poi produrranno gli anticorpi che si legheranno al corpo esterno bloccando i suoi siti attivi facilitando la fagocitosi da parte dei macrofagi. Immunità specifica cellulare: è svolta dai linfociti T citotossici che distruggono un virus che ha già infettato una cellula. La cellula T citotossica si lega alla cellula bersaglio, rilasciando perforina che forma canali sulla membrana plasmatica della cellula bersaglio

La cellula B riconosce e internalizza xenocomposti e agisce quale “antigen presenting cell” presentando gli antigeni alle cellule T CD4+ (T helper) che, riconosciuto l’antigene causano il differenziamento delle cellule B (nella milza e linfonodi) in cellule di memoria o plasmoblasti I plasmoblasti hanno la capacità di produrre anticorpi (con meno efficienza delle plasmacellule, si dividono e sono ancora in grado di agire quali antigen presenting cells e una vita di alcuni giorni prima di differenziarsi in cellula plasmatica ad opera di specifici fattori di trascrizione Le cellule plasmatiche non hanno ipermutazione somatica, non sono in grado di internalizzare e presentare l’antigene, hanno una emivita che puo’ anche essere di mesi durante I quali producono anticorpi monospecifici a una velocita di migliaia/sec.

IMMUNIZZAZIONE immunità congenita immunità naturale passiva: (es. allattamento) immunità naturale attiva

COMPONENTI DEL SISTEMA IMMUNITARIO IMMUNITA’ INNATA IMMUNITA’ ACQUISITA Risposta aspecifica Risposta specifica Risposta immediata e massima Intervallo tra esposizione e risposta massima Componenti cellulari e umorali Assenza di memoria Memoria Presente in tutte le forme di vita Presente solo nei vertebrati superiori (gnatostomi)

IMMUNIZZAZIONE immunità congenita immunità naturale attiva immunità naturale passiva: (es. allattamento) immunità artificiale attiva: vaccinazione immunità artificiale passiva: sieroterapia

IMMUNIZZAZIONE ATTIVA- risposta umorale In seguito all’immunizzazione si attivano le cellule B che esprimono sulla superficie anticorpi specifici nel riconoscere gli epitopi del vaccino. Al momento del contatto con il vaccino, in collaborazione con le cellule T helper, la cellula B si attiva e si ha una massiccia proliferazione clonale. Si originano così le plasmacellule che secernono grandi quantitativi di anticorpi solubili specifici

IMMUNIZZAZIONE ATTIVA- memoria Alcune cellule B attivate non diventano plasmacellule ma cellule della memoria Persistono per anni Il contatto con un antigene identico induce una rapida differenziazione a plasmacellule Esistono anche cellule T della memoria Le cellule della memoria si riattivano in presenza di uno stesso patogeno e danno luogo ad una reazione immunitaria più veloce ed efficace della prima.

RISPOSTA SECONDARIA

Tucidide –mosaico da Jerash, Tucidide nella sua descrizione della peste di Atene (430 ac) nota i sopravissuti alla peste potevano curare I malati senza contrarre la malattia per una seconda volta Tucidide –mosaico da Jerash, Museo Altes, Berlino

VACCINI: le prime osservazioni Osservo’ che i mungitori quotidianamente a contatto col virus vaccinico (cowpox) raramente venivano infettati “If you want to marry a woman who will never be scarred by pox, marry a milkmaid” Edward Jenner (1749 - 1823)

LE PRIME EVIDENZE Nel 1796 James Phipps (un bambino di 8 anni) fu vaccinato con materiale proveniente dalla lesione provocata dal vaiolo bovino sulla mano di Sarah Neimes 8 settimane dopo lo stesso bambino fu inoculato con il virus smallpox agente patogeno del vaiolo Il ragazzo non sviluppo’ il vaiolo Hand of Sarah Neimes. Cowpox Pustule. From Jenner’s Inquiry 1798

PERCHE’?

LE PRIME VACCINAZIONI

VACCINAZIONI SUCCESSIVE 1840 Disponibile per tutti 1841 Non obbligatoria 1853 Diventa obbligatoria 1871 Istituzione di uffici e personale addetto alla vaccinazione Multe ai genitori che non vaccinano i figli 1948 E’ ritirata l’obbligatorieta’ della vaccinazione

CRONOLOGIA DEI VACCINI 1790 Edward Jenner usò il virus vaccinico per proteggere dallo smallpox 1880 Luis Pasteur sviluppò il primo vaccino efficace per la rabbia 1890 Emil von Behring e Kitasato Shibasaburo svilupparono i vaccini per il tetano e la difterite 1900 Furono messi a punto i primi vaccini per il tifo ed il colera 1910 Il vaccino per il tetano diventò disponibile 1920 Si iniziò ad usare il vaccino per la tubercolosi 1940 Si svilupparono i vaccini per l’influenza e la pertosse 1950 Vaccini per la poliomelite (orale Sabin e Salk iniettabile) 1970 Vaccino per il meningococco 1980 I primi vaccini prodotti con la tecnologia del DNA ricombinante 1990 Sviluppo di vaccini a subunità e vaccini contro malattie autoimmuni e cancro. Produzione di vaccini in vettori virali ricombinanti

Nobel Prize in 1908 Elie Metchnikoff   Paul Ehrlich

INCIDENZA DI ALCUNE PATOLOGIE PRE E POST-VACCINAZIONE

GLI ESITI DELLE VACCINAZIONI DI MASSA PER IL VAIOLO Ultimo caso registrato a livello mondiale di “wild” smallpox Somalia Ottobre 1977 Ali Maalin (23 anni)

VACCINO COS’E’? E’ una sospensione di organismi o una frazione di organismo, usata per indurre una risposta immunitaria COME AGISCE? Simula un’infezione in maniera tale da attivare lo specifico meccanismo naturale di difesa dell’ospite contro il patogeno, così l’ospite rimane immune dalla malattia che normalmente segue all’infezione naturale

IMMUNIZZAZIONE PASSIVA COS’ E’? E’ la somministrazione di anticorpi specifici per assicurare all’ospite una protezione immediata ma di breve durata. Gli anticorpi sono isolati dal siero di pazienti convalescenti o da donatori che hanno livelli particolarmente alti di specifici anticorpi ESEMPI: - Tetano - Epatite B - Rabbia - Varicella Zoster - Siero contro il veleno di vipere e serpenti

I VACCINI: CARATTERISTICHE INNOCUO il vaccino non deve provocare malattia o morte PROTETTIVO il vaccino deve proteggere contro la malattia che deriva dall’esposizione dell’agente patogeno vivo CONFERISCE PROTEZIONE PROLUNGATA la protezione contro l’esposizione deve durare per diversi anni INDUCE ANTICORPI NEUTRALIZZANTI alcuni patogeni infettano cellule che non possono essere sostituite (es neuroni). Per prevenire l’infezione di simili cellule sono necessari anticorpii neutralizzanti CONSIDERAZIONI PRATICHE Basso costo per dose, stabilità biologica, facilità di somministrazione, pochi effetti collaterali

I VACCINI: CLASSIFICAZIONE 1- VACCINI CONVENZIONALI VIVI ATTENUATI UCCISI 2- MODERNI PERFEZIONATI CON LE TECNICHE DI INGEGNERIA GENETICA

I VACCINI VIVI ATTENUATI a- Mediante selezione di ceppi mutanti a virulenza o tossicità ridotte es: antipolio orale, polivalente contro parotite, rosolia, morbillo b- Mediante mutagenesi chimica es: Salmonella Typhi mutato con nitrosoguanidina VANTAGGI: Sono sufficienti dosi minime perché proliferano nell’ospite SVANTAGGI: - Per i vaccini virali il loro ac. nucleico può essere incorporato nel genoma dell’ospite - Possono ritornare alla forma virulenta

I VACCINI VIVI ATTENUATI-metodologie

VACCINI UCCISI: CLASSIFICAZIONE I gen. II gen. III gen. Sospensione inattivata del microrganismo patogeno. Purificazione poco o nulla Purificazione del microrganismo patogeno o del componente protettivo Combinazione di componenti protettivi o aggiunta delle proprietà immunizzanti ad esso (es: polisaccaridi coniugati a prot vettrici)

VACCINI UCCISI: organismi interi (formaldeide, aldeide glutarica) Inattivazione del microrganismo Vaccini contro pertosse, colera, febbre tifoide e antipolio Hanno alcuni svantaggi: inducono poca immunità cellulo-mediata, causano frequenti effetti avversi REAGENTI CHIMICI (formaldeide, aldeide glutarica) CALORE

VACCINI UCCISI: i tossoidi Alcuni batteri producono tossine Alcuni vaccini sono costituiti da tossine sottoposte a trattamento chimico per eliminare le proprietà tossiche = TOSSOIDI Tale preparazione ha immunogenicità relativamente scarsa, si può migliorare adsorbendo il tossoide su una sospensione di sali di alluminio Con le tecnologie moderne le tossine possono essere detossificate con mutagenesi sito-diretta, questo garantisce la riproducibilità della proteina mutante e mantiene l’immunogenicità (es: tossina della pertosse)

PRODUZIONE DI UN TOSSOIDE toxin moiety antigenic determinants chemical modification Toxin Toxoid

VACCINI COSTITUITI DA UN TOSSOIDE: meccanismo d’azione

How has the vaccine industry changed in the last several years? This industry that used to be regarded as high volume, low value, low price has been transformed into an extremely high-value, first-world-focused industry. That's come about through the realization that vaccination is an extremely cost-effective health care intervention and through the development of new products for diseases that are a heavy health burden, such as influenza and early childhood diseases. Some of these new vaccines have become $1 billion-plus blockbusters for large pharmaceutical companies. In the last few years, the vaccine industry has seen a wave of consolidation driven by Big Pharma, and in my view, this is likely to continue. In addition we have also seen the emergence of strong regional players in the emerging markets such as India and China, as well as greater collaboration between the public and private sectors. Forbes intrview to Staph Leavenworth Bakali 2009

What opportunities and innovations do you see in the industry today? Some of the big advances in vaccine research are new ways to discover novel vaccines, manufacturing technologies and delivery systems. In the past, vaccines were always administered through a needle. Now, people are working on needle-free delivery, including skin patches, oral vaccines, intranasal sprays and even vaccination via food.

Isolate virulence gene VACCINI VIVI ATTENUATI: nuove tecnologie Pathogenic virus Isolate virulence gene 1 2 Delete virulence gene Mutate virulence gene 3b 3a L’attenuazione non deve deprimere l’azione immunogena Si deve escludere il ritorno alla virulenza del microrganismo non mutazioni fini

I VACCINI A BASE DI POLISACCARIDI I semplici polisaccaridi capsulari sono antigeni scarsamente immunogeni e manifestano scarsa memoria immunologica Il loro carattere immunogeno cresce di molto se si accoppiano chimicamente a proteine vettrici contenenti epitopi in grado di attivare cellule T Tra gli esempi di vaccini coniugati di terza generazione abbiamo i vaccini polisaccaridici contro l’ Haemophilus influenzae di tipo b (ProHIBiT), recentemente introdotti in molti programmi nazionali di immunizzazione. Esso è costituito dai polisaccaridi capsulari del virus Haemophilus influenzae legati covalentemente al tossoide della difterite

NUOVE TECNOLOGIE PER LA PRODUZIONE DI VACCINI-1 1- VETTORI VIVI: per migliorare la sicurezza e l’efficacia dei vaccini si usano come vettori per gli antigeni, virus o batteri vivi inoffensivi Il virus più utilizzato a questo scopo è il virus vaccino grazie ad alcune caratteristiche: Sicurezza nell’uomo Possibilità di espressione immunogena multipla Facilità di produzione Relativa termoresistenza Adattabilità a varie modalità di somministrazione

UTILIZZO DEL VIRUS VACCINO COME VETTORE Vaccinia virus Foreign gene DNA Foreign gene Ligation Transfection Infection TK gene Vaccinia promoter Tissue culture cells Homologous recombination Antibiotic selection resistance marker Foreign gene TK-negative recombinant virus

NUOVE TECNOLOGIE PER LA PRODUZIONE DI VACCINI-2 2- PROTEINE ESPRESSE NELLE CELLULE OSPITI Per aumentare la resa, facilitare la produzione e migliorare la sicurezza dei vaccini di proteine, spesso si fanno esprimere gli antigeni proteici in cellule ospiti facilmente manipolabili e che assicurino alti livelli di espressione. Tra gli ospiti ETEROLOGHI: lieviti, batteri e linee cellulari di mammifero

Choice of an Expression System Pros & Cons

I VACCINI ANTICORPALI ANTI-IDIOTIPO Si basa sul concetto di evocare anticorpi contro il sito di legame per l’antigene dell’anticorpo protettivo Il metodo è particolarmente interessante per epitopi non proteici come carboidrati, difficili da isolare e da produrre in grandi quantità, oppure residui a struttura zuccherina di lipopolisaccaridi o glicoproteine tossiche Il principale inconveniente è che la porzione strutturale dell’anticorpo anti-idiotipo non ha relazione con la struttura dell’antigene originale, per questo se non si usano Ab umani può dare luogo a reazioni immunitarie.

I VACCINI BASATI SU PEPTIDI DI SINTESI-1 Si determinano gli epitopi immunogeni, si sintetizza chimicamente la piccola sequenza lineare peptidica che servirà da componente del vaccino. Si applica solo agli EPITOPI CONTINUI determinati unicamente dalla sequenza aminoacidica primaria. Per gli EPITOPI DUISCONTINUI si sintetizzano migliaia di peptidi a caso, poi si selezionano quelli che si legano in modo ottimale agli anticorpi protettivi

I VACCINI BASATI SU PEPTIDI DI SINTESI-2 VANTAGGI: - Si preparano in quantità illimitate - Si purificano facilmente - Non contengono materiali tossici o infettivi SVANTAGGI: - Sono scarsamente immunogeni (possono però essere sintetizzati come peptidi antigenici multipli o accoppiati ad una proteina vettrice) - Possono adottare varie conformazioni che potrebbero dare origine ad anticorpi che riconoscono il peptide e non l’antigene nativo

I VACCINI AD ACIDO NUCLEICO-1 Il soggetto vaccinato riceve il DNA plasmidico o l’RNA messaggero che codifica per l’antigene desiderato. La proteina viene espressa nelle cellule ospiti ed evoca la risposta immunitaria La via di somministrazione efficace è l’iniezione intramuscolare. Probabilmente ciò è dovuto al basso turnover delle cellule muscolari

VACCINI AD AC.NUCLEICO: meccanismo d’azione

I VACCINI AD ACIDO NUCLEICO-2 VANTAGGI: - attività immunogena intrinseca degli ac nucleici - risposta immunitaria a lungo termine - risposta sia cellulare che umorale - possibilità di produzione su larga scala SVANTAGGI: - sconosciuti gli effetti a lungo termine - possibile formazione di Ab anti-ac. nucleici - possibile integrazione nel genoma dell’ospite

ADIUVANTI Sono materiali atti ad aumentare la risposta cellulare ed umorale contro l’antigene. Generalmente hanno due proprietà: a- convertono le proteine solubili in materiale particolato che è più facilmente inglobato in cellule presentanti l’antigene, quali i macrofagi. b- Contengono un costituente batterico o prodotti microbici che aumentano la risposta immunitaria

ADIUVANTI-2

Lo sviluppo di vaccini contro Streptococcus Group B - GBS (Streptococcus agalactiae) Un batterio Gram+ I limiti: La complessità dei serotipi (almeno 9) Rappuoli, Nat Rev Microbiol. 2006

Genomic approach the genome sequences of eight GBS strains belonging to different serotypes of GBS were analysed and compared 1,811 genes (∼80% of each genome) were shared by all strains — the ‘core’ genome — and 765 genes were not present in all strains — the ‘variable’ genome86. By in silico analysis, genes encoding putative surface-associated and secreted proteins were identified from these two subgenomes: A total of 589 proteins were identified (396 ‘core’ genes and 193 ‘variable’ genes), of which 312 were successfully expressed, purified and used to immunize mice. A

The combination of four proteins, Sip (SAG0032), present in the core subgenome, and three other putative, surface-associated proteins (SAG1408, SAG0645, SAG0649), from the variable subgenome, elicited protection in infant mice and their combination proved highly protective against a large panel of GBS strains, including all circulating serotypes. This study validated the usefulness of the multigenome analysis approach in the identification

The proteomic approach

VACCINI ANTI-TUMORALI-1 Le cellule tumorali possono esprimere due tipi di antigeni: 1. TUMOR SPECIFIC ANTIGENS (TSA) Si trovano unicamente in cellule tumorali Sono dovuti a mutazioni puntiformi o al riarrangiamento di geni cellulari Alcuni antigeni tumorali sono di natura virale, derivati dai virus trasformanti: virus dell’epatite B: carcinoma epatocellulare virus Epstein-Barr: carcinoma nasofaringeo Papilloma virus umano: cancro alla cervice 2. TUMOR ASSOCIATED ANTIGENS (TAA) Si trovano sia in cellule normali che neoplastiche ma la loro espressione è generalmente alterata/aumentata in cellule tumorali Non sono riconosciute dal sistema immunitario

VACCINI ANTI-TUMORALI-2 Step 1: Identificare ed ingegnerizzare gli antigeni tumorali specifici (TSA) per essere riconosciuti dal sistema immunitario Step 2: Isolare e coltivare cellule dendritiche in presenza di antigeni tumorali, quindi introdurle nuovamente nel paziente con lo scopo di stimolare un’intensa risposta immunitaria mediata da linfociti T

Staph Leavenworth Bakali has been involved in some of the biggest vaccine exits of all time. Through various senior operating and leadership positions over a 20-year career in vaccines, Leavenworth Bakali has played a critical role in some of the most successful and leading vaccine companies. Bakali was formerly the chief operating officer of both ID Biomedical, a Vancouver, Canada-based developer of influenza vaccines that was acquired by GlaxoSmithKline for $1.4 billion; and PowderJect Pharmaceuticals, an Oxford, U.K.-based vaccine developer acquired by GlaxoSmithKline for $930 million. Bakali was also previously the director of worldwide sales and marketing at Chiron Vaccines and the director of SmithKline Beecham's Vaccine Business Unit in France. He is currently a non-executive director at Vienna, Austria-based Intercell AG. Bakali holds a master's in management from London Business School.