AA 2011/2012 Lezione 10 Valeria Benedusi CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Docente: Adriana Maggi AA 2011/2012 Lezione 10 Valeria Benedusi

REPORTERS Biological reporter: molecules acting as surrogate, measurable, indicators of a given molecular event

Geni reporter I sistemi reporter sono utilizzati per lo studio di regioni promotore o enhancer e della loro interazione con elementi trans-regolatori L’attività di un promotore e il ruolo funzionale degli elementi di controllo ivi presenti è valutata clonando questa regione a monte del gene reporter, contenuto solitamente in un plasmide di espressione. I plasmidi ricombinanti vengono poi introdotti in opportune linee cellulari in cui si va poi a quantificare la concentrazione della proteina reporter prodotta o della sua attività enzimatica

Geni reporter I geni reporter codificano per una specifica attività enzimatica che risponde a diverse caratteristiche: •deve essere assente nella specie in esame e facilmente distinguibile da ogni attività enzimatica simile presente nella cellula; •non deve presentare competizione o interferenza con altre attività enzimatiche cellulari; •il saggio deve essere semplice, rapido, sensibile e riproducibile. In saggi in cellule eucariotiche i geni reporter più usati sono quelli codificanti per enzimi batterici: CAT ( cloramfenicolo acetil transferasi) β-galattosidasi GUS (β-glucuronidasi) LUC (Luciferasi) GFP (green fluorescent protein)

Lo studio della regolazione dell’espressione genica. I sistemi reporter Elementi di regolazione trans X Proteina facilmente dosabile Z Y Promotore Gene reporter Elementi di regolazione cis Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione. Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con l’espressione del gene reporter. Questo principio può essere esteso agli animali transgenici

(Estrogen Responsive Element) Saggio reporter ER ERE (Estrogen Responsive Element)

Screening di molecole farmacologicamente attive. ER cDNA ERE LUC Potenziali ligandi LUC ER LUC Units CTR E2 CTR

I geni reporter Bassa sensibilità per mancanza di amplificazione (non è una reazione enzimatica) Monomerico, non richiede substrato, assente nei mammiferi, varianti con diversa l di fluorescenza. fluorescent proteins (GFP, varianti RFP, BFP) Elevata attività endogena in alcuni tipi cellulari. Proteina di secrezione, saggio colorimetrico molto sensibile. Fosfatasi alcalina (Umana) Richiede l’aggiunta di cofattore, O2, ATP. Alta attività specifica, mancanza di attività endogena (basso background) Luciferasi (Lucciola) Presenza di attività endogena in cellule di mammifero, enzima tetramerico (risposta non lineare) Ben caratterizzata, stabile, rilevazione automatizzabile B-Galattosidasi (Batterica) SVANTAGGI VANTAGGI GENE

Fluorescent proteins La Green Fluorescent Protein (GFP) è una proteina naturale (prodotta dalla medusa Aequorea victoria) di piccole dimensioni (238 aa 26,9 kd) che se eccitata da una radiazione nel campo dell’ultravioletto (l 395 nm), ma anche del visibile (l 475 nm, colore blu) emette una radiazione di colore verde (505 nm) Osamu Shimomura Premio Nobel 2008

Il fluoroforo di GFP è un tripepide Ser-deidroTyr-Gly che è ciclizzato: p-idrossibenzilidene-imidazolidone Nella struttura tridimensionale della GFP alcuni residui basici fanno ponti a idrogeno con atomi di ossigeno (His148 con Tyr66 e Gln94 o Arg96 con l’ imidazolidone.) stabilizzando il fluoroforo L’emissione di luce avviene tramite un meccanismo sequenziale di un processo autocatalitico in assenza di cofattori. La reazione inizia con una rapida ciclizzazione tra la Ser65 e la Gly67 per formare un prodotto intermedio (imidazolin-5-one) seguita da una reazione di ossidazione della Tyr66. La reazione è termosensibile, ma una volta prodotta la GFP è molto stabile.

La proteina è stata cristallizzata e la sua struttura determinata La proteina è stata cristallizzata e la sua struttura determinata. La GFP funziona in forma dimerica la struttura cilindrica è sostenuta da foglietti beta, le dimensioni del cilindro sono 30 Å di larghezza e 40 Å di lunghezza , segmenti ad alfa elica chiudono i cilindri da ambedue le parti e costituiscono lo scheletro per la formazione del fluoroforo che si trova al centro dei cilindri. Questa particolare struttura con foglietti beta esterni e alfa eliche interne forma una nuova classe di proteine denominata beta-can. Si tratta di una struttura molto stabile e difficilmente degradabile.

Roger Tsien, premio Nobel 2008 La conoscenza della struttura ha permesso di generare una serie di mutanti, il primo dei quali è stata una muazione puntiforme (S65T) descritta da Roger Tsien nel 1995 che migliora le caratteristiche dello spettro di emissione (509 nm) con una fluorescenza più sostenuta e più stabile nel tempo e lo spostamento del picco di eccitazione a 488 nm. Negli anni a seguire, il gruppo di Tsien ha sviluppato una vastissima gamma di proteine fluorescenti (YFP, EBFP, EBFP2, citrine, Venus, ecc) Roger Tsien, premio Nobel 2008

Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP). Citosol BFP Golgi GFP

Luciferasi Le luciferasi sono una classe di enzimi ossidativi che agendo su un substrato specifico causano la produzione di fotoni ( luciferasi di lucciola, e suoi derivati ricombinanti, Luc 2, ecc) ' (lucem ferre). luciferina + ATP → luciferil adenilato + PPi luciferil adenylato + O2 → ossiluciferina + AMP + fotoni

Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. b-Galattosidasi e Luciferasi

Utilizzo di proteine bioluminescenti o fluorescenti per studi di funzione geniche, di correlazioni-struttura-funzione, di regolazione di espressione genica

** 4 3 (fold over basal) ER activity 2 * * 1 ** ** ** ** aa 1 mM Effetto di mutazioni specifiche sulla attività trascrizionale del recettore degli estrogeni A AF-1 DBD AF-2 D F -COOH :wt :1-399 :182-599 :S122-A :C241/244-A :G525-R :L543/544-A NH 2 - ** 4 3 (fold over basal) ER activity 2 * * 1 ** ** ** ** endo wt 1-399 182-599 S122A G525R S236A C241/244A L543/544A aa 1 mM

Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene tk del virus Herpes simplex -100 -80 -60 -40 -20 +1 GC CCAAT GC TATA + + - - Generazione di mutanti + - + - + - Analisi di Northern Trascrizione in oociti di Xenopus laevis

Studio di funzione genica: l’esempio della identificazione della funzione di Nip-2 e protimosina

Prothymosin alpha (PTMA) highly acidic polypeptide of 12,6 kDa highly conserved among species widely distributed among tissues nuclear localization involved in: cell cycle progression cell growth and proliferation

associates to cell death bnip-2 expression associates to cell death 7 16 h 24h 48h 6 5 4 Cell death (dead cells/dish)x 10 2 3 5 10 15 20 1 4 16 24 48 nip2 mRNA Hours after Locke 2 1 c nip 0.5 nip 1.5 nip 2.5 Nip-2 pro-apoptotic activity is blocked by overexpression of Bcl-2 mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding domain fail to cause apoptosis Meda et al. 2001

TRANSFEZIONE DI bnip2/PROT-A cDNA IN MCF-7 CELLS CTRL PTMA BNIP2 100 75 50 25 200 150 %survival % proliferation apoptosi proliferazione

STUDI DI STRUTTURA-FUNZIONE

Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007)

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

High-throughput Screening (1) Elaborazione digitale dei dati La possibilità di automatizzare la detezione del reporter consente uno screening ad “alto flusso”. Elaborazione digitale dei dati Library di molecole Saggio biologico automatizzabile Piattaforma Robotizzata

High-throughput Screening (2) 1990. 20 ricercatori 1.5 milioni di molecole/anno Oggi. 4 ricercatori 2.5 milioni di molecole/anno I più moderni saggi di screening consentono la determinazione della POTENZA e della SPECIFICITA’ della sostanza testata.

Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Analisi struttura funzione delle proteine eucariote Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) RICERCA DI BASE Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) APPLICAZIONI INDUSTRIALI Produzione di biofarmaci

INGEGNERIA CELLULARE TRASFEZIONE TRANSIENTE STABILE RANDOM SCREENING (scelta vettore; promotore; costrutto) TRASFEZIONE STABILE TRANSIENTE SCREENING FARMACI RANDOM INTEGRATION Kin GENE FUNCTION PRODUZIONE PROTEINE GENE FUNCTION STUDI STRUTTURA- FUNZIONE

PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL’ INGEGNERIA GENETICA A cosa possono servire le proteine ricombinanti? -proteine di interesse terapeutico. -proteine di interesse commerciale (enzimi). -proteine da utilizzare come antigeni per la produzione di anticorpi policlonali e monoclonali. -reagenti per la ricerca di base e applicata.

Produzione di biofarmaci La produzione delle proteine terapeutiche in microorganismi non è sempre possibile soprattutto per le modificazioni post-traduzionali L’utilizzo di cellule animali consente di ottenere prodotti proteici strutturalmente più simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà tecniche e costi più elevati.

MANIPOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA IN CELLULE EUCARIOTICHE Vantaggi rispetto a sistemi procariotici -formazione corretta di ponti disolfuro -folding corretto -taglio proteolitico da precursore -glicosilazione -modificazione di aa (fosforilazione, acetilazione, miristilazione, ecc.)

PROGRAMMAZIONE DI UN ESPERIMENTO DI INGEGNERIA CELLULARE SCELTA DEL SISTEMA CELLULARE DISEGNO DEL VETTORE DI ESPRESSIONE MODIFICAZIONE DEL SISTEMA CELLULARE CLONAGGIO CELLULE CON ALTA ESPRESSIONE, STABILITA’, SENSIBILITA’ A OSMOLARITA’ E pCO2 OTTIMIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA SCALING UP (DA 3 A 10000 L)

TPA (tissue plasminogen activator) ricombinante Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di mammifero Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini Assenza di attività tossica per l’uomo Stabile integrazione di geni eterologhi Crescita in sospensione o monostrato Modificazioni post-traduzionali corrette

REATTORE PER CRESCITA DI CELLULE EUCARIOTE

Moreira Biopharm Int. 2007

CRESCITA DI CELLULE IN MONOSTRATO ROLLER BOTTLES CELL CUBES

CRESCITA DI CELLULE IN MONOSTRATO CELL FACTORY

CRESCITA DI CELLULE IN MONOSTRATO MICROCARRIER IN VASCHE AGITANTI

IMPIANTO DI FERMENTAZIONE PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE

Difficoltà nella produzione di biofarmaci Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento nell’impianto pilota Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. Controllo delle condizioni di produzione Recupero e produzione CONTROLLO QUALITA’ Caratterizzazione del prodotto

Controllo di qualità di proteine terapeutiche Caratterizzazione della proteina Determinazione dello stato di purezza Saggio biologico SDS PAGE/Western Saggio immunologico HPLC SDS PAGE Western Presenza di proteine seriche Isoelectrofocusing Presenza di proteine cellulari HPLC Presenza pirogeni Mappa peptidica Presenza di DNA cellulare Sequenziamento N-terminale Spettrometria di massa Composizione in carboidrati Composizione in acido sialico

Difficoltà nella produzione di biofarmaci Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento nell’impianto pilota Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. Controllo delle condizioni di produzione Recupero e produzione CONTROLLO QUALITA’ Caratterizzazione del prodotto