Tecniche Chiro-ottiche Misura differenziale dell’interazione di molecole chirali con luce polarizzata OR optical rotation ORD optical rotatory dispersion CD circular dichroism

Molecole chirali ed attività ottica La chiralità è la proprietà di avere un’immagine speculare non sovrapponibile. Le molecole chirali sono otticamente attive: a) ruotano il piano di polarizzazione della radiazione e.m. polarizzata linearmente; b) presentano un diverso assorbimento della radiazione polarizzata circolarmente destra o sinistra. Una molecola chirale e la sua immagine speculare sono dette enantiomeri o isomeri ottici. I due enantiomeri ruotano il piano di polarizzazione dello stesso angolo ma in direzioni opposte (enantiomeri levogiro L e destrogiro D). Amminoacidi:in natura esistono solo enantiomeri L

Molecole chirali ed attività ottica (2) Molecola (cromoforo) chirale Disposizione chirale delle molecole (cromofori)

Tecniche Chiro-ottiche Coinvolgono tutte la misura differenziale dell’interazione di molecole chirali con luce polarizzata OR optical rotation misura l’entità della rotazione del piano della luce linearmente polarizzata ad una certa lunghezza d’onda CD circular dichroism misura la differenza in assorbimento tra la luce polarizzata a destra e a sinistra, a diverse lunghezze ORD optical rotatory dispersion misura OR a diverse lunghezze d’onda (poco utilizzato rispetto al CD)

Web Tutorial http://cddemo.szialab.org/index.html I. Basic concepts: Electromagnetic waves and types of polarization Plane-polarized wave: Horizontal Plane-polarized wave: Vertical Superposition of plane-polarized waves: Horizontal + Vertical  45º Plane Superposition of plane-polarized waves: Horizontal + Vertical  Right circular Superposition of plane-polarized waves: Horizontal + Vertical  Left circular Circularly polarized waves: Right and Left Superposition of circularly polarized waves: Right + Left circular  Plane! II. Interaction of light and matter Plane-polarized wave: Absorption Circularly polarized wave: Absorption Plane-polarized wave: Refraction Circularly polarized wave: Refraction Circular dichroism Circular birefringence Circular dichroism AND birefringence

Radiazione e.m. Notazione complessa: Propagazione nel mezzo: n = indice di rifrazione κ = coefficiente di assorbimento

Luce piano-polarizzata o linearmente polarizzata Un’ onda elettromagnetica si dice polarizzata linearmente quando il suo vettore campo elettrico E (così come il vettore campo magnetico) oscilla sempre nella stessa direzione. Il piano individuato dalla direzione di oscillazione del campo elettrico e dalla direzione di propagazione dell’onda è il piano di polarizzazione. z Onda piana polarizzata linearmente lungo z: il campo elettrico oscilla nel piano xz E M FILTRO POLARIZZATORE Un metodo comune di polarizzazione è l’assorbimento della luce in una lamina polaroid. Tale materiale contiene molecole di idrocarburi a lunga catena che vengono allineate se durante il processo di fabbricazione la lamina viene stirata in una direzione. Queste catene diventano conduttrici a frequenze ottiche se la lamina viene immersa in una soluzione contenente iodio. Quando la luce incide con il suo vettore campo elettrico parallelo alle catene, si creano correnti elettriche lungo le catene e l’energia luminosa viene assorbita. Se il vettore campo elettrico è perpendicolare alle catene, la luce viene trasmessa. La direzione perpendicolare alle catene è chiamata asse di trasmissione. x Direzione di propagazione

Radiazioe polarizzata linearmente o piano-polarizzata Polarizzazione lineare lungo l’asse y Polarizzazione lineare lungo l’asse x

Polarizzazione lineare Generalizzazione:sovrapposizione tra onde polarizzate linearmente in 2 piani perpendicolari Polarizzazione lineare A 45° dall’asse x In generale: La grandezza relativa delle due componenti E0x, E0y determina il piano di polarizzazione

Radiazione polarizzata circolarmente Un’ onda elettromagnetica si dice polarizzata circolarmente quando il suo vettore campo elettrico E ruota attorno ad un asse di propagazione z mantenendo costante il modulo e descrivendo un giro in un periodo T, cioè in una . Il vettore E descrive un’elica La rotazione di E nel piano xy: y E x z Direzione di propagazione E Right- handed Left- Convenzione: polarizzazione destrogira: guardando verso la sorgente si vede ruotare E in senso orario

Polarizzazione lineare vs circolare Luce polarizzata linearmente: Direzione del vettore campo elettrico costante,intensità variabile Luce polarizzata circolarmente: Direzione del vettore campo elettrico variabile, intensità costante

Radiazione polarizzata circolarmente destra e sinistra Destrogira Levogira

Radiazione polarizzata circolarmente: combinazione di due onde polarizzate linearmente Un’onda polarizzata circolarmente può essere descritta come somma vettoriale di due onde polarizzate linearmente di uguale frequenza ed ampiezza, con i piani dei loro vettori elettrici mutualmente perpendicolari e sfasate di 90° (¼ di lunghezza d’onda)

Radiazione polarizzata circolarmente: combinazione di due onde polarizzate linearmente (2) onda polarizzata linearmente a 45° somma di onde perpendicolari in fase onda polarizzata circolarmente somma di onde perpendicolari sfasate

Radiazione polarizzata linearmente: combinazione di due onde polarizzate circolarmente Un’onda polarizzata linearmente può essere descritta come somma vettoriale di due onde polarizzate circolarmente, verso destra l’una e verso sinistra l’altra, con I vettori elettrici di uguale frequenza ed ampiezza.

Radiazione polarizzata linearmente: combinazione di due onde polarizzate circolarmente (2)

Radiazione polarizzata ellitticamente Il vettore elettrico E ruota attorno all’asse di propagazione z a cui è normale, compiendo un giro in una lunghezza d’onda, variando armonicamente il proprio modulo, da un massimo a ad un minimo b b a  Ellitticità  tg=b/a rapporto tra asse minore ed asse maggiore Rotazione ottica  = angolo di orientazione di E rispetto ad un piano di riferimento Elisse semiasse maggiore e minore

Ellitticità  tg = ER-EL/ER+EL E R - L E R + L

Interazione luce-materia Quando la radiazione e.m si propaga nella materia le sue proprietà possono cambiare. Può modificarsi: 1. Intensità (assorbimento di radiazione) 2. Velocità (indice di rifrazione) 3. polarizzazione II. The interaction of light and matter If light enters matter, its properties may change. Namely, its intensity (amplitude), polarization, velocity, wavelength, etc. may alter. The two basic phenomena of the interaction of light and matter are absorption (or extinction) and a decrease in velocity. Absorption means that the intensity (amplitude) of light decreases in matter because matter absorbs a part of the light. (Intensity is the square of amplitude.) The decrease in velocity (i.e. the slowdown) of light in matter is caused by the fact that all materials (even materials that do not absorb light at all) have a refraction index, which means that the velocity of light is smaller in them than in vacuum. The refraction index is the ratio of the velocities of light measured in vacuum and in the given material. The following animations present these basic phenomena

ε≠0 n=c/v=1 Radiazione polarizzata linearmente ed assorbimento Propagazione nel mezzo All’ingresso del mezzo All’uscita del mezzo

ε≠0 n=c/v=1 Radiazione polarizzata circolarmente e assorbimento Se il mezzo attraversato ha indice di rifrazione >1 la radiazione si propaga con velocità minore ed essendo l’energia della radiazione hv costante e quindi anche la frequenza, Anche la lunghezza d’onda risulta minore All’ingresso del mezzo All’uscita del mezzo

Radiazione polarizzata linearmente nel mezzo rifrangente ε=0 n=c/v>1 Es. n=2.2, L=8 Vettori non oscillano in fase The distance between the intersecting planes in front of and behind the piece of material is exactly 8 times the vacuum wavelength of the EM wave. The two field vectors at the intersecting planes do not oscillate in the same phase any longer All’ingresso del mezzo All’uscita del mezzo

Radiazione polarizzata circolarmente nel mezzo rifrangente ε=0 n=c/v>1 Es. n=2.2, L=8 All’ingresso del mezzo All’uscita del mezzo

Luce polarizzata linearmente E stessa fase stessa ampiezza Componete EL Componete ER Un composto è OTTICAMENTE ATTIVO se interagisce in modo diverso con le 2 componenti polarizzate circolarmente e quindi se ER e EL hanno: Velocità diverse nell’attraversare il mezzo otticamente attivo: nL  nR escono sfasate Fenomeno della ROTAZIONE OTTICA Vmezzo = c/n n indice di rifrazione del mezzo Assorbimenti diversi nell’attraversare il mezzo otticamente attivo: L  R escono con ampiezza diversa Fenomeno del DICROISMO CIRCOLARE

Birifrangenza circolare e rotazione ottica Hip.   ASS nL  nR Luce polarizzata linearmente Luce polarizzata linearmente Campione otticamente attivo  nL  nR   (l)

Birifrangenza circolare e rotazione ottica (2) Sostanze otticamente attive, con indice di rifrazione diverso nL≠nR per la radiazione polarizzata circolarmente a sinistra e a destra ruotano il piano di polarizzazione della luce polarizzata linearmente di un angolo . : rotazione ottica nL – nR: birifrangenza circolare nL< nR All’ingresso del mezzo All’uscita del mezzo

Considerazioni Il potere ottico rotatorio è la conseguenza della diversa entità della rifrazione della luce polarizzata circolarmente destrorsa e sinistrorsa ad opera di molecole chirali non raceme. Tale fenomeno (che produce l’angolo di rotazione misurato) è dovuto alla birifrangenza cioè un “rallentamento diseguale” della luce polarizzata destrorsa e sinistrorsa (nR  nL) quando la luce passa attraverso la sostanza otiicamente attiva. La dispersione ottica rotatoria (ORD) riflette il medesimo fenomeno al variare della lunghezza d’onda. 27

Birifrangenza circolare e rotazione ottica (3) In assenza di birifrangenza circolare, n = 0 Radiazione polarizzata linearmente In presenza di birifrangenza circolare, n  0 Equazioni di FRESNEL L’equazione di Fresnel correla l’angolo misurato alla differenza degli indici di rifrazione per la luce circolarmente polarizzata destrorsa e sinistrorsa dove

Birifrangenza circolare e rotazione ottica (4) In presenza di birifrangenza circolare, n  0 Radiazione polarizzata linearmente ma ruotata di un angolo: Birifrangenza circolare Rotazione ottica in radianti, l (cammino ottico) in cm Rotazione ottica in gradi, l (cammino ottico) in cm Rotazione ottica positiva , in senso orario guardando sorgente luminosa, radiazione polarizzata linearmente destrorotatoria Rotazione ottica negativa, in senso antiorario, levorotatoria

Rotazione specifica e molare Rotazione specifica in gradi cm3 / g dm misurata a una particolare T e  (riga D del Na, 589 nm) attraverso un dm di cammino ottico quando sia presente 1 g di sostanza in 1 cm3. C0 = concentrazione in g cm-3 d = cammino ottico in decimetri Rotazione Molare in gradi / M cm C = concentrazione in M l = cammino ottico in centimetri 30

Rotazione specifica e molare (2) Rotazione Media per Residuo in gradi / M cm PMres = PMtot/n peso molecolare medio per residuo n numero di residui

Dispersione ottica rotatoria ORD La dipendenza della rotazione ottica dalla lunghezza d’onda è detta dispersione ottica rotatoria. La curva ORD è un plot di [] o [] vs  Rotazione oraria viene plottata positiva, antioraria negativa Positive Cotton effect is where the peak is at a higher wavelength than the trough Negative Cotton effect is the opposite Optically pure enantiomers always display opposite Cotton effect ORD curves of identical magnitude Zero crossover point between the peak and the trough closely corresponds to the normal UV max La determinazione della rotazione specifica [a] in funzione della lunghezza d’onda si definisce dispersione ottica rotatoria (ORD). La lunghezza d’onda esercita infatti la maggiore influenza sui valori di [a] ed il comportamento dei composti può essere diviso in due principali classi: Se il composto non assorbe in modo significativo (cioè non possiede gruppi cromofori) si osserva una curva monotona in cui il valore assoluto di [a] decresce all’aumentare della lunghezza d’onda Se il composto assorbe (cioè presenta gruppi cromofori) in corrispondenza della lunghezza d’onda di assorbimento UV-Visibile da luogo ad una curva anomala caratterizzata da un minimo un massimo e un punto di inflessione. Questa anomalia prende il nome di effetto Cotton ORD curve is a plot of molar rotation [] or [M] vs  Clockwise rotation is plotted positively; counterclockwise rotation is plotted negatively n. b. – ORD is based solely on the index of refraction So-called plain curve is the ORD for a chiral compound that lacks a chromophore Chiral compounds containing a chromophore can give anomalous, or Cotton effect, curves Il segno della curva non ha alcun significato in merito alla configurazione assoluta che può essere ricavata per confronto con analoghi strutturali a configurazione nota ORD per composti chirali in assenza di cromofori sono curve semplici monotone. La presenza di cromofori che assorbono nel range esplorato da luogo all’effetto Cotton. 32

Hip.  = ASS nL = nR L = R Dicroismo circolare Campione otticamente attivo Luce polarizzata linearmente Luce polarizzata ellitticamente Hip.  = ASS nL = nR L = R I casi possibili fin’ora esaminati sono raggruppabili in tre categorie: Il raggio polarizzato attraversa un mezzo achirale: si hanno eguali velocità dei due raggi polarizzati: polarizzazione circolare senza rotazione del raggio risultante Il raggio polarizzato attraversa un mezzo chirale che non assorbe nel range di l considerato: si hanno diverse velocità dei due raggi polarizzati con rotazione del raggio circolare risultante Il raggio polarizzato attraversa un mezzo chirale che assorbe nel range di l considerato: si hanno diverse velocità e diseguali assorbimenti dei due raggi polarizzati, con ottenimento di un raggio risultante ruotato e polarizzato ellitticamente Quando le componenti circolarmente polarizzate vengono assorbite differentemente dal campione si ha CD. Il vettore somma non sta più sul piano di polarizzazione iniziale ma inizia a descrivere una traiettoria elicoidale

εL≠ εR Dicroismo circolare (2) All’ingresso del mezzo All’uscita

εL≠ εR nL ≠ nR Dicroismo circolare e birifrangenza circolare All’ingresso del mezzo All’uscita del mezzo

Dicroismo circolare (3) Misura la differenza di assorbimento della luce polarizzata circolarmente a sinistra e a destra DA(l) = AL(l)-AR(l) = [eL (l) - eR (l)]lc DA(l) = De (l)lc De < 10 M-1cm-1 e tipicamente 20 000 M-1cm-1 Il segnale CD è una differenza molto piccola tra due valori grandi! Measurement of how an optically active compound absorbs right- and left-handed circularly polarized light All optically active compounds ex-hibit CD in the region of the appropriate absorption band CD is plotted as l-r vs  For CD, the resulting transmitted radiation is not plane-polarized but elliptically polarized is therefore the angle between the initial plane of polarization and the major axis of the ellipse of the resultant transmitted light CD is usually plotted as [] Then, Δe = (eL – eR) is the molar circular dichroism. This is what is usually meant by the circular dichroism of the substance. Although ΔA is usually measured, for historical reasons most measurements are reported in degrees of ellipticity. Molar circular dichroism and molar ellipticity, [θ], are readily interconverted by the equation [θ] = 3298.2 Δe

Elliticità  When ER equals EL (when there is no difference in the absorbance of right- and left-circular polarized light), θ is 0° and the light is linearly polarized. When either ER or EL is equal to zero (when there is complete absorbance of the circular polarized light in one direction), θ is 45° and the light is circularly polarized. Le funzioni iperboliche (seno iperbolico, coseno iperbolico, tangente iperbolica, cotangente iperbolica, secante iperbolica, cosecante iperbolica) sono definite nel modo seguente sinh(x)=ex-e-x/2    cosh(x)=ex+e-x/2   tgh(x)=sinh(x)cosh(x)

Elliticità ed elliticità molare q elliticità q = arctg(b/a)=2.303*(180/4)*DA in gradi q = 32.98 CD in gradi dove CD =DA(l) = De (l) C l elliticità molare [q] = q / C l in gradi M-1cm-1 [q] = 100 q / C l in gradi cm2 dmol-1 [q] = 3298 De in gradi cm2 dmol-1 dove: C: molarità del soluto l: cammino ottico in cm

Luce polarizzata ed attività ottica b Rotazione ottica Elliticità Birifrangenza circolare Dicroismo circolare Sperimentalmente si misurano solo Rotazione ottica e Dicroismo circolare: per campioni biologici α tra 0.01-0.1 gradi per C=10-4 e 1 cm cammino ottico, A tra 0.03 a 0.3% risppetto assorbimento totale.

Grandezze spettroscopiche ellitticita’ specifica potere rotatorio specifico in gradi cm3/g dm ellitticita’ molare potere rotatorio molare in gradi /M cm ellitticita’ molare potere rotatorio molare per residuo per residuo in gradi /M cm La differenza dei coefficienti di assorbimento molare De può essere correlata al valore di J con la seguente formula: Psi e alfa grandezze specifiche Theta e phi Nel dicroismo si misura De e si ricava J. De = assorbimento dicroico differenziale

ORD vs CD Le bande CD corrispondono a bande di assorbimento ORD è un fenomeno di dispersione pertanto le sue bande corrispondono alla derivata dello spettro CD (effetto Cotton) Gli strumenti moderni operano in CD poiché è più facile risolvere bande parzialmente sovrapposte Bande CD sono di piu’ facile assegnazione (corrispondenza con bande in assorbimento)

[α] [θ] ε ORD CD Abs. λ Effetto Cotton positivo negativo Comportamento dei due antipodi ottici di un’identica sostanza chirale in corrispondenza della medesima transizione elettronica. Il segno dell’effetto Cotton si deduce dal segno della curva a maggiori valori di lunghezza d’onda La curva CD è non nulla solo in prossimità della banda di assorbimento UV. Nella curva ORD la parte piana va oltre la zona di assorbimento Spettri CD sono gaussiane Deflessioni positive o negative dipendono dal segno di  o [] e corrispondono al segno dell’effetto Cotton Il massimo del CD si ha a max Il CD è più facile da interpretare soprattutto in presenza di overlap di bande dicroiche ORD spectra are dispersive (called a Cotton effect for a single band) whereas circular dichroism spectra are absorptive. The two phenomena are related by the so-called König-Kramers transforms. ε Abs. λ

ORD CD Abs. Banda otticamente inattiva