TECNICHE DI CARATTERIZZAZIONE DI COMPOSTI VOLATILI ED AROMATICI IN MATRICI ALIMENTARI MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA Massimo Baldizzone

FINALITÀ DELLA RICERCA CHIMICO ENOLOGICO CHIMICO ANALITICO ALTERNATIVE ALLE METODICHE IN USO SVILUPPO METODO ANALITICO Lo studio vuole promuovere attraverso considerazioni di tipo chimico e statistico il ruolo di eccellenza che il Brachetto d’Acqui ha acquisito tra i grandi aromatici italiani con la finalità di verificare come la varietà aromatica sia qualificante per la qualità del vino e correlata alle condizioni e dalla zona di produzione VARIETÀ AROMATICA QUALIFICANTE VALIDAZIONE PRIMARIA (ISO 17025)

GLI AROMI SONO RAPPRESENTATI DA CENTINAIA DI COMPOSTI A CONCENTRAZIONE VARIABILE TRA mg/L E ng/L VARIETÀ TERRENO CLIMA TECNICHE COLTIVAZIONE METABOLISMO DELL’UVA FENOMENI BIOCHIMICI Origine: Metabolismo dell'uva: correlato alla varietà, al terreno, al clima ed alle tecniche di coltivazione della vite. Fenomeni biochimici: (ossidazione ed idrolisi) che accadono prima e dopo la fermentazione, Metabolismo dei microrganismi responsabili delle fermentazioni alcolica e malolattica Reazioni chimiche o enzimatiche che accadono dopo la fermentazione, durante l'invecchiamento del vino in tino, barilotto e bottiglia METABOLISMO MICROBICO FERMENTAZIONE POST- FERMENTAZIONE INVECCHIAMENTO REAZIONI CHIMICO – FISICHE ED ENZIMATICHE

I COMPOSTI AROMATICI TERPENI LIBERI TERPENI GLICOSILATI ALDEIDI CHETONI OSSIDI ALCOLI MONO, DI,TRI-IDROSSILATI IDROCARBURI TERPENICI ESTERI MONOSACCARIDI E DISACCARIDI DEGLI ALCOLI E DEGLI OSSIDI SCARSAMENTE VOLATILI E OLFATTIVAMENTE NON AVVERTIBILI APPARTENGONO A DIFFERENTI CLASSI DI COMPOSTI ORGANICI molecole natutali formati da unità isopreniche più o meno modificate (terpenoidi); classificati in base al numero di unità isopreniche da cui sono costituiti Hanno un ruolo importante nel mondo degli aromi in quanto rappresentano composti profumati presenti in natura. Piante frutta vino ecc

Monoterpene idrocarburico 4 CH3 3 5 2 1 1 2 C 3 CH3 CH2 4 5 Limonene

Alcol monoterpenici CH3 CH3 CH2OH OH H CH2 C C CH3 CH3 CH3 CH3 Geraniolo Linalolo

Monopreni aldeidici CH3 CH3 H CHO H CHO C C Nerale Geraniale

ALCOLI SUPERIORI E POLIALCOLI I COMPOSTI AROMATICI NORISOPRENOIDI ALCOLI SUPERIORI E POLIALCOLI La degradazione ossidativa dei carotenoidi, terpeni con 40 atomi di carbonio (tetraterpeni) produce derivati con 9, 10, 11 atomi di carbonio. Questi residui derivati dai norisoprenoidi con 13 atomi di carbonio posseggono proprietà odorose interessanti. ESTERI VOLATILI FLOREALE

UNICA FRAZIONE ISTITUTO SPERIMENTALE DI ENOLOGIA METODO SVILUPPATO FRAZIONE IDROFILA FRAZIONE LIPOFILA FRAZIONE GLICOSILATA UNICA FRAZIONE STRUTTURA PER ESTAZIONE SPE CONDIZIONI DI ESTRAZIONE NON RIPRODUCIBILI CARICO SORBENT SATURAZIONE SORBENT DETERMINAZIONE TRAMITE METODO AGGIUNTE STANDARD Per estrazioni successive si ottengono frazioni con caratteristiche differenti NO RECOVERY STANDARD INTERNO STANDARD INTERNO

ATTIVITA’CATALITICA AR 2000 Terpene glicosilato: Glucoside: R-OH

STUDIO DEL PROBLEMA ANALITICO TIPOLOGIA DEGLI ANALITI RICERCATI CLASSI CHIMICHE DIFFERENTI PROPRIETÀ CHIMICO - FISICHE NON OMOGENEE LIVELLI DI CONCENTRAZIONE ATTESI CONCENTRAZIONE VARIABILE: DA ng/L A mg/L ANALITI APPARTENENTI A CLASSI CHIMICHE DIFFERENTI CARATTERISTICHE CHIMICHE NON OMOGENEE CARATTERISTICHE DELLA MATRICE MATRICE COMPLESSA

STUDIO DEL PROBLEMA ANALITICO ATTENZIONE ALLE FASI DI CAMPIONAMENTO E DI TRATTAMENTO DEL CAMPIONE VALUTAZIONE DELLE TECNICHE DI CAMPIONE E DI CLEAN-UP ANALITI APPARTENENTI A CLASSI CHIMICHE DIFFERENTI CARATTERISTICHE CHIMICHE NON OMOGENEE

TECNICHE DI CALIBRAZIONE NO CALIBRAZIONE ESTERNA EFFETTO MATRICE TECNICHE DI CALIBRAZIONE CALIBRAZIONE ESTERNA NO CALIBRAZIONE ESTERNA STANDARD INTERNO PROVE DI ESTRAZIONE HANNO EVIDENZIATO COME LA MATRICE NEL SUO COMPLESSO ABBIA UN EFFETTO SUL SEGNALE DEL SINGOLO ANALITA INFLUENZANDO LA PERNDENZA DELLA RETTA DI CALIBRAZIONE AI LIVELLI DI CONCENTRAZIONE DEL METODO PRECEDENTE INSIEME DI EFFETTI ASCRIVIBILI A SOSTANZE PRESENTI NELLA MATRICE IN ESAME CHE PROVOCANO L’ABBASSAMENTO ED IN ALCUNI CASI LA SOPPRESSIONE TOTALE DEL SEGNALE DELL’ANALITA. Al livello di concentrazione del metodo precedente è evidente come la matrice avesse effetto sulla pendenza della retta di calibrazione Al livello di concentrazione attuale non si ha effetto matrice quindi tra i possibili metodi di calibrazione abbiamo selezionato il metodo delle addizioni standard. ADDIZIONE STANDARD

27 STANDARD TRA TERPENI ALCOLI ED ESTERI ADDIZIONI STANDARD AD UN CAMPIONE A 4 LIVELLI DI CONCENTRAZIONE Livelli di [ ] in µgL-1 0,0 µgL-1 100,0 µgL-1 200,0 µgL-1 500,0 µgL-1 SONO EFFETTUATE DILUIZIONI PER CUI L’EFFETTO SULLA SENSIBILITA’ DELLA MATRICE E NELL’ORDINE DELL’ERRORE SPERIMENTALE CON LE ADDIZIONI STANDARD VALUTO IL RECUPERO A QUEL LIVELLO DI CONCENTRAZIONE PER OGNI ANALITA È STATO COSTRUITO UN MODELLO DI CALIBRAZIONE DEL PRIMO ORDINE DEL TIPO Y = B0 + B1X MODELLO DEL PRIMO ORDINE: Y = B0 + B1X

È STATO VERIFICATO COME LA DILUIZIONE ABBIA RIDOTTO L’EFFETTO SULLA PENDENZA AD UN VALORE NELL’ORDINE DELLA VARIABILITÀ DEL SISTEMA SI È UTILIZZATO IL MODELLO CALCOLATO PER OGNI ANALITA CON L’ADDIZIONE STANDARD COME CALIBRAZIONE PER LA DETERMINAZIONE DEI COMPOSTI CONSIDERATI IN 18 BRACHETTI RAPPRESENTATIVI DELLA ZONA DI PROBUZIONE Y = B0 + B1X Y = B1X

(single-laboratory method validation) “IN HOUSE” VALIDATION (single-laboratory method validation) ASSICURARE L’ATTUABILITÀ DEL METODO PRIMA DI EFFETTUARE UNO STUDIO INTER LABORATORIO FORNIRE EVIDENZA DELL’AFFIDABILITÀ DEL METODO ANALITICO NELLE CONDIZIONI OPERATIVE PROPOSTE PARAMETRI DI QUALITÀ DEL METODO : RANGE DINAMICO LINEARE ACCURATEZZA E PRECISIONE SELETTIVITÀ E SPECIFICITÀ LIMITE DI RILEVABILITÀ (LOD) LIMITE DI QUANTIFICAZIONE (LOQ) RECUPERO

INTERVALLO DINAMICO E INTERVALLO LINEARE INTERVALLO DINAMICO DI LINEARITÀ: INTERVALLO MASSIMO PER IL QUALE È SODDISFATTA LA RELAZIONE Y= B0+B1X 0,0 – 500,0 µg/L R2 = 0,987 INTERVALLO DI LINEARITÀ: INTERVALLO DI LINEARITÀ: INTERVALLO DI UNO O PIÙ ORDINI DI GRANDEZZA ALL’INTERNO DEL QUALE VIENE VERIFICATA LA VALIDITÀ DELLA RELAZIONE LINEARE Y= B0+B1X Al di sopra dei 500 ppb si perde la linearità nella risposta. Intervallo di linearità: dove presuppongo che vi sia linearità 0,0 – 1000,0 µg/L R2 = 0,767

ERRORI CASUALI IN FASE DI PRECONCENTRAZIONE RECOVERY SUL SORBENT 35%- 70% 500,0 µg/L ERRORI CASUALI IN FASE DI PRECONCENTRAZIONE STANDARD INTERNO 1- EPTANOLO

Condizioni operative GC-MS GC-MS STATION Condizioni operative GC-MS Colonna polare tipo INNOVAX. lunghezza 30 m, i.d. 0,25. Gas di trasporto:He. Tipo di iniezione: splitless. apertura valvola dopo 2 minuti. Tempo di corsa: 93 minuti. Rate °C/min Final temp °C Final Time Min Level 1 42 60 2.00 Level 2 2.0 190 Level 3 5.0 230 15.00 SIM SELECTED ION MONITORING

Range di concentrazione nei brachetti in μgL-1 LOD μgL-1 LOQ Ret. Time Min. Composto Range di concentrazione nei brachetti in μgL-1 LOD μgL-1 LOQ 5,898 Acido butanoico, 2 metil estere Nr-65 13 ± 0,7 51 ± 2,3 6,083 Acido butanoico, 3 metil estere Nr-239 15 ± 0,7 46 ± 2,3 7,266 1 butanolo, 3 metil acetato 257- 777 7± 0,3 21 ± 1,1 8,803 Alfa Terpinene 297-712 31 ± 2 95 ± 6,1 9,637 Acido esanoico etil estere 386-737 14 ± 0,7 43 ± 2,2 10,680 Gamma Terpinene Nd-180 32 ± 1,6 94 ± 4,75 12,030 Acido acetico, esil estere 1268-5873 158 ± 8 290 ± 14,5 14,863 Acido eptanoico, etil estere 727-1058 14 ± 1 43 ± 2,6 15,039 Acido propanoico, 2-idrossi, etil estere 370-1058 14 ± 0,57 42 ± 1,75 15,558 1 esanolo Nd 15,590 3 etossi,1 propanolo 266-580 7 ± 0,2 22 ± 0,65 17,070 3 esen-1-olo Nr-500 8 ± 0,26 24 ± 1,37 19,800 Acido ottanoico etil estere 466-780 9 ± 0,45 27 ± 1,35 Sono presenti alcuni analiti presenti al di fuori dell’intervallo di linearità delle calibrazioni. L’applicazione del metodo per questi analiti non è affidabile come per gli altri.

Acido nonanoico, etil estere 76-480 12 ± 0,76 36 ± 2,28 26,000 21,285 3 metil,1 butil pentoato? Nd 21,611 Cis linalolo ossido 232 - 400 23 ± 1,2 68 ± 3,80 25,647 Acido nonanoico, etil estere 76-480 12 ± 0,76 36 ± 2,28 26,000 Linalolo 90-276 11 ± 0,38 34 ± 2,15 27,088 5 metil, 2 Furancarbossialdeide Nr-341 47 ± 2,04 142 ± 6,51 30,408 2 Decanolo 551-1024 7 ± 0,44 21 ± 1,23 31,153 Acido decanoico etil estere 198-396 16 ± 0,99 49 ± 3,05 33,308 Acido butandioico dietil estere 34,408 Alfa Terpineolo 56 - 466 6 ± 0,25 19 ± 1,18 34,509 Gamma Terpineolo Nr - 400 63 ± 5,68 190 ± 17,1 38,669 Beta Citronellolo Nr - 483 4 ± 0,14 13 ± 0,48 40,238 Nerolo Nr - 540 9 ± 0,7 29 ± 2,38 42,581 Alfa Ionone Nr - 535 10 ± 0,87 32 ± 2,80 42,764 Geraniolo Nr - 493 6 ± 0,49 18 ± 1,47 Nr: Non rilevabile Nd: Non determinato