Applicazioni avanzate della gascromatografia nelle analisi alimentari Laurea Magistrale in Chimica Applicazioni avanzate della gascromatografia nelle analisi alimentari Gascromatografia veloce (Fast GC) e gascromatografia bidimensionale (GC x GC) Bologna, 13 Novembre 2009 Federico Ferioli

Caratteristiche strumentali ed applicazioni della gascromatografia veloce (Fast GC) La gascromatografia capillare (CGC) rappresenta la tecnica strumentale più adatta per l’analisi di miscele complesse di composti volatili e semi-volatili; diversi sono i settori in cui la gas cromatografia capillare trova applicazione: alimentare, ambientale, farmaceutico, medico. L’impiego di colonne capillari relativamente lunghe (≥ 30 m, 0,25 mm i.d.) ha come conseguenza tempi di analisi elevati (30-180 min). Negli ultimi 15-20 anni l’interesse della comunità analitica si è rivolto verso lo sviluppo di metodi gascromatografici che garantissero un’elevata capacità di separazione ma in tempi relativamente brevi.

Miglioramenti strumentali Fasi dell’analisi gas cromatografica Preparazione del campione. Iniezione del campione, separazione e rivelazione. Raffreddamento del sistema cromatografico. Elaborazione dei dati. Le prime due fasi influenzano significativamente i tempi e i costi di analisi, selettività e sensibilità, robustezza, accuratezza e precisione del metodo. L’utilizzo di colonne a ridotto diametro interno (“narrow bore”) consente di ottenere tracciati analoghi a quelli ottenuti con colonne capillari convenzionali ma in temi 5-10 volte inferiori. Colonne narrow-bore con un’ampia gamma di fasi stazionarie Possibilità di utilizzo della Fast GC Miglioramenti strumentali

Storia della Fast GC 1960’s: Desty dimostra il potenziale di colonne con diametro interno ridotto. Problema: mancanza di un sistema automatizzato di iniezione del campione. Altri espedienti: colonne multicapillari, colonne capillari più corte, colonne wide-bore mantenute sotto vuoto, programmi di temperatura accelerati. Utilizzo di colonne capillari narrow-bore Caratteristiche strumentali richieste Rapido sistema di iniezione automatizzato; Elevati pressioni in testa alla colonna; Elevati rapporti di splittaggio; Rampe di temperatura accelerate; Veloce acquisizione dei dati.

Scopo dell’utilizzo della Fast GC Garantire una capacità risolutiva ed un efficienza confrontabili con quelle della GC convenzionale; Ridurre i tempi di analisi da 3 da 10 volte; Attendibilità dei risultati analitici . Scelta del gas di trasporto Velocità lineare del gas di trasporto Lunghezza e diametro interno della colonna Spessore della fase stazionaria Velocità della rampa di temperatura Parametri analitici correlati con l’utilizzo della Fast GC

GC covenzionale vs. Fast (e Ultra fast) GC: caratteristiche strumentali ed analitiche Parametro analitico GC convenzionale Fast GC/Ultra fast GC Diametro interno colonne 0,25-0,32 mm 0,10-0,18 mm (Fast GC) ≤ 0,050 mm (Ultra fast GC) Lunghezza delle colonne 25-100 m 5-15 m Spessore fase stazionaria 0,25-5 μm 0,05-0,40 μm Tempi di analisi 30-180 min 2-30 min Gas di trasproto Elio, idrogeno Idrogeno

Tutti i parametri vanno ottimizzati insieme Principi della Fast GC Decremento dei tempi di analisi: Colonne capillari più corte; Elevate velocità lineari del gas di trasporto; Rapide rampe di temperatura. La perdita in efficienza viene compensata da: Minor diametro interno delle colonne (“narrow bore”); Film di fase stazionarie meno spesso; Idrogeno come gas di trasporto. Tutti i parametri vanno ottimizzati insieme Riduzione dei tempi di analisi + risoluzione cromatografica accettabile

Pressione in testa alla colonna Ad un decremento del diametro interno segue un incremento della contropressione del sistema. Dimensioni della colonna Colonna per fast GC: ≤ 20 m, 0,10-0,18 mm I.D. Un diametro interno ridotto garantisce: un miglior rapporto segnale rumore (aumento della sensibilità); riduce la resistenza al trasferimento di massa degli analiti nella fase gassosa; riduce l’allargamento di banda rispetto alle colonne convenzionali in quanto gli analiti sono diluiti in un volume minore di gas di trasporto.

Capacità delle colonne Le colonne narrow-bore utilizzate in fast GC sopportano quantità di campione ridotte rispetto alla GC convenzionale (films sottili di fase stazionaria). Per evitare il sovraccarico della colonna elevati e riproducibili rapporti di splittaggio devono essere utilizzati (flussi di splittaggio: 1200 mL/min) La sensibilità del sistema cromatografico viene garantita dalla formazione di picchi più stretti. Rivelazione degli analiti I picchi prodotti dalla fast GC sono stretti. I detector devono possedere un’elevata velocità di acquisizione dei dati; una velocità di acquisizione lenta può condurre ad errori in fase di quantificazione. Una velocità di acquisizione troppo elevata può portare ad un’elevato rumore di fondo e ad un decremento della sensibilità. 10 punti per la metà superiore del picco sono sufficienti per una corretta ricostruzione del picco.

Efficienza delle colonne narrow-bore Efficienza: risoluzione degli analiti e capacità di ridurre l’allargamento di banda. A parità di lunghezza, una diminuzione del diametro interno della colonna porta ad un incremento dell’efficienza (numero di piatti). Colonna 10 m x 0.10 mm I.D., 0,10 μm ≈ Colonna 25 m x 0,25 mm I.D., 0,25 μm (≈ 100000 piatti teorici). Colonne narrow-bore (< 0,25 mm I.D.) relativamente corte (10-15 m) offrono un’efficienza analoga o superiore a quella di colonne più larghe ma con diametro interno maggiore.

Curve di Golay: HETP vs. ū Colonne narrow-bore consentono di operare a velocità lineari maggiori ū: velocità lineare (cm/sec) alla quale il gas di trasporto si muove in colonna. ūopt: velocità lineare ottimale alla quale l’efficienza della colonna è massima. ū < ūopt: elevata risoluzione, tempi di analsi elevati, picchi allargati. ū > ūopt: tempi di analisi ridotti, picchi distorti, risoluzione inadeguata. Per ottenere tempi di analisi ridotti senza perdere in efficienza si deve adottare una velocità lineare la più elevata possibile, che fornisca prestazioni analoghe a quelle ottenute con ūopt. HETP (altezza equivalente a un piatto teorico): lunghezza della colonna in cui si verifica la ripartizione dell’analita tra fase stazionaria e fase mobile. HETP è una misura dell’efficienza della colonna. Curve di Golay: HETP vs. ū

Idrogeno come gas di trasporto Elevata efficienza + Riduzione dei tempi di analisi Punti di minimo delle curve: He, 0,109 mm, 45 cm/sec; H2, 0,093 mm, 70 cm/sec. Per l’idrogeno si osservano i più bassi valori di HEPT rispetto agli altri gas usati come carrier in GC (minor allargamento di banda, maggior efficienza). L’idrogeno mostra la velocità ottimale più elevata e garantisce minori tempi di analisi. La curva di Golay dell’idrogeno è relativamente piatta intorno al punto di minimo: possibilità di operare ad elevate velocità lineari senza una significativa perdita di efficienza. Sono richieste precauzioni di sicurezza nell’utilizzo dell’idrogeno (es.: utilizzo di generatori al posto delle bombole).

Applicazioni della FAST GC - FAMEs PUFA di origine marina

Applicazioni della FAST GC - FAMEs PUFA di origine marina

Applicazioni della FAST GC - Aromi Oli essenziali di limone

Applicazioni della FAST GC - Aromi Allergeni in un profumo commerciale

Applicazioni della FAST GC - Pesticidi Pesticidi organoclorurati

Applicazioni della FAST GC - Pesticidi Pesticidi organoclorurati

Fast GC e determinazione degli acidi grassi trans Perché quantificare con accuratezza gli acidi grassi trans negli alimenti: esiste una relazione fra il consumo di alimenti contenenti acidi grassi trans e i livelli del colesterolo LDL; elevati livelli di colesterolo LDL sono associati all’aumento del rischio di coronopatie (coronary heart disease, CHD). Cosa sono gli acidi grassi trans (grasso trans): derivano dall’idrogenazione di oli liquidi, processo che ne aumenta la consistenza e la stabilità. Principali alimenti contenenti acidi grassi trans: oli vegetali, crackers, dolciumi, cibi cotti al forno, biscotti, spuntini, cibi fritti, condimenti per insalata e altri alimenti confezionati. La Food and Drug Administration (FDA) ha recentemente imposto che la quantità di acidi grassi trans di un alimento sia inclusa nella lista Nutrition Facts. Necessità di metodo analitico efficiente per la quantificazione degli acidi grassi trans

GC capillare: strumento più usato per la separazione degli isomeri cis-trans in campioni di alimenti. Estrazione della sostanza grassa Derivatizzazione degli acidi grassi nei corrispondenti esteri metilici (FAME) Analisi CGC Punti critici: velocità dell’analisi e risoluzione delle coppie critiche Strategie usate per applicare la Fast GC nell’analisi dei FAME: Impiego di colonne narrow bore (<0,25 mm I.D.); Maggiori velocità lineari; Programmi di temperatura veloci; Idrogeno come gas di trasporto.

Selettività della fase stazionaria della colonna: Colonne polari in polietilene glicole: risolvo i FAME in base al grado di insaturazione; Colonne molto polari a base di cianosilicone: risolvono gli isomeri cis/trans e gli isomeri posizionali e geometrici. Tempi di analisi molto brevi (< 5 min) ma minima risoluzione degli isomeri cis/trans.

Per la risoluzione degli isomeri cis/trans è necessaria una colonna altamente polare a base cianosiliconica. I tempi di analisi restano brevi e migliora la separazione dei gruppi isomerici cis e trans, con gli isomeri trans che eluiscono prima dei cis.

Risoluzione degli isomeri posizionali cis e trans: viene generalmente condotta utilizzando colonne cianopropiliche lunghe (100 m). Colonne narrow-bore di media lunghezza non hanno fornito prestazioni soddisfacenti anche per la limitata capacità di campione e la tendenza a sovraccaricarsi.

Per ridurre i tempi di analisi sono state prese in considerazione colonne da 0,18 mm (i.d.). Una colonna cianopropilica da 75 mm e 0,18 mm di diametro interno offre una risoluzione simile a quella della colonna da 100 m in un tempo di analisi significativamente più breve.

Ultra Fast GC Alta produttività Elevata accuratezza Velocità di analisi

Cosa si intende per ULTRA FAST GC L’ULTRAFAST e’ una tecnica gascromatografica che permette l’utilizzo di rampe termiche con notevoli incrementi di temperatura. Tecnica Velocita’ di riscaldamento (°C/min) GC tradizionale fino a 20 Fast GC fino a 120 Ultra fast GC fino a 1200

Il modulo colonna nel forno Il modulo Ultra-Fast GC è installato in un Trace GC ULTRA con un rivelatore Fast FID (ad alta velocità di acquisizione) Opzioni possibili: SSL/FID PTV/FID Column module can be removed and the GC be used for conventional applications

flessibile e reversibile Ultra fast GC: il forno Il riscaldamento della colonna avviene per contatto diretto con l’elemento riscaldante; la ventola del forno viene utilizzata solo nella fase di raffreddamento del cassetto. Strumento: flessibile e reversibile Trace GC Ultra può essere utilizzato come un forno tradizionale a circolazione di aria in combinazione con altri iniettori (es.: on-column).

Riproducibilita’: stabilita’ della rampa termica UFGC (direct resistive heating) Forno convenzionale per “fast” GC

La colonna è montata in una scatola di metallo Modulo ULTRAFAST La colonna è montata in una scatola di metallo Colonna capillare Elemento riscaldante Sensore di temperatura Fibra ceramica Assemblaggio della colonna Il sensore della temperatura e l’elemento riscaldante avvolgono la colonna e sono inclusi nel modulo DIMENSIONI: le colonne sono normalmente da 2,5,10 metri con diametro interno di 0,1 mm; ma con possibilità su richiesta di avere altre dimensioni.

Modulo ULTRAFAST: vantaggi Tempi di analisi più veloci anche di 30 volte Vita media di una colonna più lunga (1000 cicli, più di 3 volte di una colonna tradizionale) Riproducibilità dei tempi di ritenzione elevata Alta sensibilità anche nell’analisi di composti in tracce Compressione dei picchi Possibilità di lavorare in splitless Tempo di raffreddamento da 350°C a 50 °C circa 1 min. Tempo medio di analisi qualche minuto

Esempi di applicazioni Alimenti & Aromi FAMEs Oli essenziali Fragranze Ambiente Oli minerali (ISO 9377-2, ISO TR 11046) PAH, Ftalati VOC Petrolchimica Sim-Dist (D2887 – D3710) Olefine Chimica-Farmaceutica Solventi

Petrolchimica:Ultra Fast Sim-Dist - D2887 Campione di riferimento di oli (ASTM 2887) UltraFast GC (meno di 80 sec) Tradizionale GC (25 min)

Petrolchimica:Ultra Fast Sim-Dist - D2887 Standard Colonna: 5 m x 0,32 mm i.d., 0,25 µm RTX1 Programma di temperatura: 40°C (0,1’), 5°C/s to 370°C (0,5’) Reference oil 90 sec

Ultra Fast: Estrazione con Spazio di Testa C5-C13

Alimenti: Esteri metilici degli acidi grassi UFGC GC tradizionale

Alimenti: Esteri metilici in olio di oliva 1 6 7 Col.: MEGAWAX 5m x 0,1mm, 0,2um FT Temperature program: 150 (10 s), 1,7 °C/s, 250 (20 s) Conventional GC (20 min.) 5 2 8 9 10 11 14 13 4 12 3 1) Palmitic (C16:0) 5) Stearic (C18:0) 9) Arachidic (C20:0) 13) Lignoceric (C24:0) 2) Palmitoleic (C16:1) 6) Oleic (C18:1n9c) 10) Eicosenoic (C20:1) 14) Nervonic (C24:1) 3) Heptadecanoic (C17:0) 7) Linoleic (C18:2n6c) 11) Behenic (C22:0) 4) Heptadecenoic (C17:1) 8) Linolenic (C18:3n6) 12) Tricosanoic (C23:0)

Fragranze: Analisi di oli essenziali linalool linalyl acetate d-germacrene Colonna: 5 m x 0,1 mm i.d., 0,1 µm OV1 Programma di temperatura: 50°C(0,1’), 150°C/min to 250°C (1’) Split Ratio 1:600 Salvia 100 sec b-cariophyllene cis-b-ocimene a-terpineol geranyl acetate trans-b-ocimene bicycle d-germacrene neryl acetate limonene sclareol linalyl acetate linalool g-terpinene limonene a-pinene b-pinene myrcene Bergamotto 50 sec

Ambiente:oli minerali in acqua e terreno GC convenzionale Raffreddamento Ultra Fast GC 5 cicli completi al posto di 1!

Analisi di n-alcani in modalita’ splitless (1 ng/ul) Campione: nC10-nC25 mix, 1-2 ng/ul Solvente: n-pentane Colonna: 5 m x 0,1 mm i.d., 0,1 um RTX5 Programma di temperatura: 40 (0,3’) to 330°C @ 5°C/s Liner: 105 mm x 2 mm i.d. Tempo di splitless: 0,2 min Surge pressure: 400 kPa for 0,2 min Carrier: H2 @ 1 ml/min Volume iniettato 0,5 ul 1 2 3 4 6 5 7 8 9 1 nC10 2 nC12 3 nC14 4 nC16 5 nC18 6 nC20 7 nC22 8 nC23 9 nC25 Time (s)

Riproducibilita’: tempi di ritenzione/area dei picchi (modalita’ splitless) Analisi di n-alcani Composto ½ Height width (s) RT Aree Media (s) SD (s) Media (counts) RSD% 1 nC10 0,145 31,39 0,027 404595 1,9 2 nC12 0,115 39,07 0,019 596563 1,3 3 nC14 0,095 44,78 0,016 631625 1,1 4 nC16 0,100 49,64 0,018 632721 1,7 5 nC18 0,110 54,05 1086338 6 nC20 58,08 731104 1,5 7 nC22 0,120 61,76 719224 8 nC23 63,49 684827 1,8 9 nC25 0,130 66,76 764068 Good repeatability for both, considering also the low volume injected of 0.5 ul Peak width are similar to those obtained with split injection (at the same heating rate) – No influence of slow SL transfer on separation power – Good cold-phase refocusing

Ambiente: Analisi di PAHs (Splitless) Separation of critical pairs 14 15 Meno di 2,5 min (2°C/s) 11 12 1 2 4 6 5 7 8 9 10 11 12 13 16 14 15 3 Time (s)

Analisi degli Olii essenziali: Menta (colonna apolare) 1 2 6 7 5 11 12 8+9+10 4 3 13 16 15 17 14 18 19 Courtesy of Prof. Bicchi (Torino University) menthol Column: RTX5 5m x 0,1 mm i.d., 0,1 um FT T prog.: 50 to 250 at 2,5 °C/s 55 s 1) a-Pinene 6) g-Terpinene 11) Menthol 16) Menthyl acetate 2) Sabinene Hydrate 7) Menthone 12) Terpinenene-4-ol 17) b-Cariophyllene 3) b-Pinene 8) i-Menthone 13) a-Terpineol 18) D-Germacrene 4) 1,8-Cineole 9) Menthofurane 14) Pulegone 19) Viridifluorol 5) Limonene 10) neo-menthol 15) Piperitone

Analisi degli Olii essenziali: Menta (colonna polare) 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Courtesy of Prof. Bicchi (Torino University) menthol Col.: MEGA-WAX 5m x 0,1 mm i.d., 0,1 um FT T prog.: 50 to 250 at 2,5 °C/s 70 s 1) a-Pinene 7) 1,8-Cineole 13) Menthyl acetate 19) a-Terpineol 2) b-Pinene 8) g-Terpinene 14) neo-menthol 20) Germacrene 3) Sabinene Hydrate 9) Menthone 15) Terpinenene-4-ol 21) Piperitone 4) Myrcene 10) Menthofurane 16) b-Cariophyllene 22) Viridifluorol 5) p-Cymene 11) i-Menthone 17) Menthol 6) Limonene 12) Linalool 18) Pulegone

Doping-droghe: hashish Per cortesia del Prof. Gambaro Università Milano - Farmacia THC CBD i.S. CBN Minuti 1.3 CBD = Cannabidiolo THC = Tetraidrocannabinolo CBN = Cannabinolo Colonna: RT-X 5; 5 m, 0,1 mm i.d., 0,1 µm film. T prog: 50°C per 0,10 sec; 600°C/min fino a 150°C; 180°C/min fino a 320°C per 0,29 sec.

Conclusioni La combinazione di colonne narrow-bore con il sistema di riscaldamento diretto della colonna, permette di ridurre i tempi analitici mantenendo un’ottima riproducibilità dei tempi di ritenzione soprattutto nelle analisi di routine. L’uso di questa tecnologia associata all’iniettore PTV amplia la gamma di composti analizzabili in tempi rapidi. La possibilità di lavorare in splitless o a bassi rapporti di splittaggio mostra che il sistema è valido anche per le analisi di composti in tracce.

Gascromatografia bidimensionale estesa (2DGC Estesa) Una porzione del campione viene separata sulla prima colonna (prima dimensione) e successivamente inviata ad una seconda colonna (seconda dimensione) per ulteriore separazione secondo differenti principi fisici. La prima colonna generalmente apolare: separa tramite i Punti di Ebollizione (BP). La seconda colonna generalmente polare: separa tramite l’affinità chimica (polarità).

2D GC Tecnica Convenzionale Cromatogramma dalla prima colonna dimensionale Cromatografia normale Cromatografia 2D Heart-cut Crom. dalla seconda colonna dimens.

La GC bi-Dimensionale convenzionale vs. 2DGC ESTESA Cromatografia normale Cromatografia 2D bidimensionale convenzionale (heart-cut) Solo poche frazioni del campione sono separate sulla seconda dimensione 2D GC Estesa Tutto il campione è separato su entrambe le dimensioni

Vantaggi della tecnica 2D GC Estesa Enorme potere di separazione: elevata capacità separativa (numeri di picchi che possono essere separati) Nella “normale”colonna capillare n = 1100 2a dimensione (2a colonna) GC estesa n = 35 Dimensione 2 Dimensione 1 2D GC Estesa n GCxGC = 1100 x 35 = 38.500 GC-GC bidimensionale convenzionale n = 1100 + 1100 = 2200

Vantaggi della tecnica 2D GC - Il potere di separazione della 2D GC Estesa è notevolmente più alto della GC capillare convenzionale. - 2D GC Estesa offre una migliore sensibilità rispetto alla GC convenzionale: la forma dei picchi è decisimente più stretta. - 2D GC Estesa permette una migliore identificazione dei picchi se confrontata con la GC convenzionale: la eluizione dei picchi è caratterizzata da due tempi di ritenzione. - 2D GC Estesa è compatibile con tutti i sistemi di iniezione e tecniche di campionamento usate in GC convenzionale ad una sola dimensione. - 2D GC Estesa riduce la necessità di manipolazione di campioni complessi: la capacità separativa è così grande da isolare le interferenze critiche che normalmente sono presenti nella GC convenzionale.

2D GC Estesa GCxGC: Diagramma a macchie

2D GC Estesa GCxGC: Contour Plot 1 Dimensione 2 Dimensione Punto di ebollizione Polarità Separazione 2D-GC

2D GC Estesa: analisi di gasoline

Tecnica 2D GC Estesa Second dimension relative retention times (s) First dimension retention time (minutes)

Analisi dei VOCs EPA 502-524 1 Dim 17+18 12+13+14 19+20+21 4 16 22 11 5+6+7 11 15 23 24 3 9+10 1+2 8 1 chlorobenzene 2 1,1,1,2-tetrachloroetane 3 ethylbenzene 4 p/m-xylene 5 bromoform 6 styrene 7 o-xylene 8 1,1,2,2-tetrachloroethane 9 1,2,3-tricholoropropane 10 isopropylbenzene 11 bromobenzene 12 2-chlorotoluene 13 n-propylbenzene 14 4-chlorotoluene 15 impurity 16 1,3,5-trimethylbenzene 17 tert-butylbenzene 18 1,2,4-trimethylbenzene 19 1,3-dichlorobenzene 20 sec-butylbenzene 21 1,4-dichlorobenzene 22 p-isopropyltoluene 23 1,2-dichlorobenzene 24 n-butylbenzene

Schema del Sistema GCxGC Colonna capillare convenzionale Focalizzazione pulsata di  10 ms e re-iniezione 50 volte più veloce della 1st colonna Rivelatore veloce Sampling rate  100 Hz Iniettore capillare convenzionale

TRACE 2DGC Modulatore “Dual Jet” CO2 jet CO2 jet J.Beens et al., Journal of Chromatography A, 919 (2002) 121-132

2D GC Estesa : maggiori campi di applicazione

Questa nuova tecnica potrebbe cambiare radicalmente il mercato della GC Considerazioni ricavate da pubblicazioni di settore: “Sensibilità 25-50 volte in più e un potere risolutivo 10 volte maggiore, qualunque applicazione ne trarrebbe un sicuro profitto dalla innovazione tecnologia provata della 2D GC” “Con la 2D-GC vengono ridotti i costi delle procedure di pre-trattamento del campione oltre al risparmio di tempo nell’adottare due colonne in configurazione ortogonale: due criteri che viaggiano in tandem”

Grazie per l'attenzione!!! Contatti: Federico Ferioli Dipartimento di Scienze degli Alimenti Università degli Studi di Bologna (Sede di Cesena) Tel.: 0547-338117/148 E-mail: federico.ferioli@unibo.it – federico.ferioli@virgilio.it – federico.ferioli@hotmail.it