IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI Enrico Tortoli

L’approccio tradizionale Test biochimici Test colturali

Test biochimici Accumulo di niacina Riduzione dei nitrati Catalasi semiquantitativa Idrolisi del Tween 80 Ureasi Riduzione del tellurito Arilsolfatasi β-glucosidasi

Niacina Prodotto del metabolismo micobatterico accumulato nel terreno requisiti della coltura l’estrazione la rivelazione 24 ore Distingue M. tuberculosis dalle altre specie Irregolarmente positiva in M. simiae Raramente positiva in altri micobatteri

Nitrati Molte specie micobatteriche sono in grado di ridurre i nitrati a nitriti 4 ore

Catalasi a 68°C Praticamente tutti i micobatteri producono catalasi In quasi tutte le specie, ad eccezione di quelle del M. tuberculosis complex la catalasi è termoresistente incubazione a 68°C per 20 min rivelazione con H2O2 20 min

Idrolisi del Tween 80 Alcuni micobatteri possiedono una esterasi, grazie ad essa sono in grado di idrolizzare il Tween 80 Utilizzando Tween legato a rosso neutro, l’idrolisi è evidenziata dal viraggio al rosso 10 giorni

Test colturali Velocità di crescita Temperature di crescita Pigmento Morfologia delle colonie Test di inibizione selettiva

Velocità di crescita I micobatteri a crescita rapida formano colonie visibili ad occhio nudo in meno di una settimana I micobatteri a crescita lenta possono richiedere anche 6 settimane Il test deve essere eseguito utilizzando un inoculo standardizzato Il tempo richiesto per la crescita nella coltura primaria non è indicativo Il tempo richiesto per la crescita in coltura liquida non è indicativo

Temperature di crescita Il range delle temperatura che permettono lo sviluppo delle varie specie batteriche è ampio Oltre all’incubazione a 37°C è necessario testare almeno altre due temperature, 25-30°C e 42‑45°C

Pigmento I micobatteri si distinguono in: non cromogeni scotocromogeni fotocromogeni

Morfologia delle colonie Aspetto macroscopico Aspetto microscopico (10x)

Morfologia delle colonie M. tuberculosis

Morfologia delle colonie M. xenopi

Morfologia delle colonie M. avium

Test di inibizione selettiva L’aggiunta al terreno di particolari sostanze permette di distinguere le specie che ne tollerano la presenza, da quelle che ne risultano inibite TCH NaCl Tiacetazone Idrossilamina (MacConkey)

Identificazione Confronto dei risultati dei test con i dati presenti in letteratura (tabelle)

Conclusioni Non esistono kit commerciali I tempi sono estremamente lunghi Non tutti i test sono perfettamente riproducibili L’affidabilità delle identificazioni è buona solo per le specie più comuni Non permettono di riconoscere i micobatteri rari o “nuovi” Alcuni test possono essere utilizzati, in maniera mirata, per dirimere ambiguità emergenti da altri sistemi di identificazione Permettono di differenziare M. tuberculosis dalle altre specie del M. tuberculosis complex

L’analisi dei lipidi La parete dei micobatteri è caratterizzata da un contenuto lipidico elevatissimo Acidi micolici Acidi grassi saturi ed insaturi Alcol

Gli acidi micolici Acidi grassi, ramificati in posizione β Presenti nella parete batterica dei generi: Corynebacterium: 22-38 atomi di C Rhodococcus: 34-52 atomi di C Nocardia: 44-60 atomi di C Gordonia: 48-66 atomi di C Tsukamurella: 64-78 atomi di C Mycobacterium: 60-90 atomi di C Presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici alfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, wax ester-, omega' metoxi-mycolati

La parete dei micobatteri altri lipidi complessi acidi micolici arabino-galattano peptidoglicano membrana cellulare

Cromatografia su strato sottile Separazione, mediante opportuni solventi, dei vari acidi micolici presenti nell’estratto depositato su una piastra di gel di silice Evidenziamento degli stessi dopo idonea colorazione Identificazione delle “macchie” in base alla loro posizione rispetto al fronte di avanzamento del solvente (fase mobile) Identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi micolici

Cromatografia su strato sottile

Gas-cromatografia Pirolisi degli acidi micolici in esteri metilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di C Separazione gas-cromatografica dei prodotti di clivaggio nonché degli acidi grassi saturi ed insaturi (fra i quali l’acido tuberculostearico) e degli alcol Identificazione delle catene di C preferibilmente usando la spettrometria di massa Identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi grassi

Gas-cromatografia

Il principio della HPLC La fase mobile è spinta ad elevata pressione attraverso la fase stazionaria (particelle paccate) contenuta nella colonna Il campione viene iniettato direttamente all'interno del flusso della fase mobile La separazione delle varie frazioni del campione è determinata dalla diversa polarità delle due fasi Le frazioni eluite vengono quantificate in base alla loro assorbanza

Le componenti del sistema iniettore pompe colonna detector solventi cromatogramma recorder

Preparazione del campione Saponificazione un’ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°C Estrazione aggiunta di cloroformio dopo acidificazione evaporazione dello strato non acquoso aggiunta di bicarbonato ed ulteriore evaporazione solubilizzazione del residuo secco in cloroformio Derivatizzazione esterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza di catalizzatore, per 40 min a 80°C evaporazione e aggiunta al residuo secco di cloroformio, ac. cloridrico e metanolo recupero ed evaporazione dello strato di cloroformio

Identificazione dei picchi 1 TRR=5,3/9,6 SI 5,3 9,6

Identificazione dei picchi 2 SI1 SI2

Esempi di profili HPLC M. tuberculosis M. simiae

Conclusioni TLC: il numero di specie con pattern sovrapponibili è molto elevato GLC: difficile standardizzazione della metodica; le differenze quantitative sono difficilmente interpretabili HPLC: elevato potere discriminante, ma il numero delle specie non differenziabili è in continua crescita

PCR Restriction Analysis hsp65: gene altamente conservato Digestione con un enzima di restrizione specifico per un sito di restrizione non molto frequente Determinazione del pattern di restrizione in base al numero ed alle dimensioni dei frammenti ottenuti Confronto con pattern di restrizione appartenenti a specie note

Il metodo Amplificazione di una porzione di 439 bp all’interno del hsp65 Digestione di 2 aliquote di amplificato usando, su ciascuna, un diverso enzima di restrizione Separazione elettroforetica dei prodotti di digestione presenti in ciascuna aliquota di amplificato Determinazione, per confronto con pesi molecolari noti, delle dimensioni dei frammenti (quelli inferiori a 40 pb vengono ignorati) Uso di un algoritmo per raggiungere l’identificazione di specie

Gli enzimi di restrizione BstEII nessuna digestione (440 bp) produzione di 2-3 frammenti (320-80 bp) HaeIII produzione di 2-5 frammenti (265-40 bp)

hsp65 PRA: l’algoritmo Differenziazione delle specie, all’interno del pattern di restrizione prodotto da BstEII, in base al pattern prodotto da HaeIII BstEII HaeIII 200/60/50 bp M. chelonae 150/105 bp M. haemophilum 320 bp 130 bp 120 bp 185/130 bp M. terrae 145/130/50 bp M. simiae 130/115/60 bp M. gordonae 130/95/75/60 bp M. kansasii . . . . . .

Sviluppi Determinazione delle dimensioni esatte dei frammenti mediante sequenziamento Presenza di un sito Internet (PRA-Site) contenente tutti i pattern di restrizione delle specie batteriche note

Conclusioni Di facile esecuzione ed economico Svariate specie sono caratterizzate da più di un pattern (fino a 9) Alcune specie hanno pattern indistinguibili

DNA-probe Enorme risparmio di tempo rispetto all’identificazione tradizionale Specificità elevata Disponibili per un numero limitato di specie Costose

DNA-probe commerciali AccuProbe (GenProbe) INNO LiPA Mycobacterium (Innogenetic) GenoType Mycobacteria (Hain)

AccuProbe Bersaglio: rRNA 16S Reazione: ibridizzazione in fase liquida, direttamente dalle colonie Rivelazione: in chemioluminescenza (HPA) Specificità: M. tuberculosis complex MAC o, in alternativa, M. avium e M. intracellulare separatamente M. kansasii M. gordonae Limiti: test a cascata non disponibili per specie comuni in Europa ma rare negli USA

Ibridizzazione inversa

INNO LiPA Mycobacterium Bersaglio: regione spaziatrice fra i geni codificanti per rRNA 16S e 23S Reazione: ibridizzazione inversa, con 21 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità: Mycobacterium genere M. tuberculosis complex M. kansasii (differenziazione dei tipi I, II, III-IV-V-M. gastri) M. xenopi M. gordonae M. avium M. intracellulare M. chimaera MAC M. scrofulaceum M. fortuitum M. marinum-M. ulcerans M. genavense M. haemophilum M. chelonae (differenziazione dei tipi I, III, II-IV) M. smegmatis M. malmoense M. celatum M. simiae Limiti: alcune reattività crociate con specie rare

GenoType Mycobacteria Bersaglio: gene codificante per rRNA 23S Reazione: ibridizzazione inversa del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) con varie sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità: Mycobacterium genere M. tuberculosis complex M. kansasii-M. gastri M. xenopi M. gordonae M. avium M. intracellulare M. scrofulaceum-M. parascrofulaceum-M. paraffinicum M. malmoense-M. haemophilum-M.palustre-M. nebraskense M. peregrinum-M. alvei-M. septicum M. chelonae-M. immunogenum M. fortuitum-M. mageritense M. abscessus-M. immunogenum M. interjectum M. marinum-M. ulcerans Mycobacterium genere M. simiae M. mucogenicum-M. ratisbonense M. celatum I, III M. phlei M. szulgai-M. intermedium M. immunogenum M. haemophilum-M. nebraskense M. ulcerans M. gastri M. lentiflavum M. heckeshornense M. shimoidei M. genavense-M. triplex Limiti: incorretta identificazione dei MAC non-M. avium, non-M. intracellulare alcune reattività crociate con specie rare numerose identificazioni non univoche

GenoType Mycobacteria MTBC Bersaglio gene codificante per rRNA 23S gene girB regione RD1 Reazione: ibridizzazione inversa, con 9 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) Specificità: M. tuberculosis complex M. tuberculosis M. africanum tipo I M. microti M. bovis M. bovis BCG M. caprae Limiti: mancato riconoscimento di M. africanum tipo II, di M. canettii e di M. pinnipedii

Identificazione mediante sequenziamento genico

Prima del sequenziamento Scelta del bersaglio Presente in tutti gli organismi Conservato ma contenente regioni variabili Disponibilità di un database contenente le sequenze con cui si vuol confrontare il bersaglio Scelta dei primer Estrazione del DNA dalle cellule

Le fasi del sequenziamento Amplificazione del bersaglio Verifica dell’amplificato Purificazione PCR di sequenziamento Purificazione dell’amplificato

Miscela di sequenziamento Primer Due amplificazioni parallele usando in ciascuna un solo primer (per il filamento forward o reverse) Tampone Polimerasi Nucleotidi Nucleotidi terminator

Nucleotidi terminator Nucleotide (A) che blocca l’allungamento del filamento di ac. nucleico poiché la mancanza del gruppo ossidrile in 3’ impedisce l’attacco all’ac. fosforico del nucleotide successivo

PCR di sequenziamento (metodo manuale) Si esegue in quattro provette diverse Tutte e quattro le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali e primer Ciascuna delle quattro provette contiene inoltre un diverso tipo di nucleotide terminator (adenina-terminator, guanina-terminator, . . .) Annealing del primer Allungamento del primer: Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca In ciascuna delle 4 provette contenente nucleotidi terminator con una diversa base azotata si formano soltanto filamenti che terminano con tale base. Tali filamenti avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°, . . , ennesima, posizione possibile

Separazione dell’amplificato (metodo manuale) Si esegue una elettroforesi disponendo i prodotti di amplificazione delle 4 provette in 4 corsie parallele così che in ognuna di esse siano presenti filamenti che terminano con una diversa base Si usa un gel ad altissima risoluzione, capace di separare frammenti di DNA che differiscono fra loro per un solo nucleotide. Il gel (0,3-0,4 mm di spessore) è interposto fra due lastre di vetro di notevole lunghezza (40 cm circa ).

Il principio del sequenziamento (metodo manuale) La migrazione è inversamente proporzionale alla lunghezza del filamento La posizione della banda indica la posizione occupata all’interno della sequenza, mentre il tipo di base è indicato dalla corsia in cui tale banda si trova A T A C A G C T G T T . . . . . .

Nucleotidi terminator marcati (metodo automatico) I nucleotidi terminator sono marcati con un fluorocromo Si usa un fluorocromo diverso per ciascuno dei quattro tipi di terminator

PCR di sequenziamento (metodo automatico) Si esegue in una singola provetta Tutte le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali, nucleotidi terminator e primer Annealing ed allungamento del primer: Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca Si formano, nella stessa provetta, filamenti che avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°, . . , ennesima, posizione della sequenza. Si avranno quindi filamenti terminanti con ciascuna delle quattro basi

Il prodotto della PCR (sequenziamento automatico) Se il bersaglio è composto da n nucleotidi si avranno filamenti di tutte le lunghezze possibili, da 1 ad n Indipendentemente dalla lunghezza, tutti i filamenti terminanti con adenina emetteranno fluorescenza di tipo A ; quelli terminanti con citosina, di tipo B; quelli terminanti con guanina, di tipo C, e quelli terminanti con timina, di tipo D

L’elettroferogramma Il sequenziatore automatico è un apparecchio che, dopo aver prelevato il prodotto della PCR di sequenziamento, lo sottopone ad elettroforesi all’interno di un capillare Durante l’attraversamento del capillare i vari spezzoni di DNA vengono colpiti da un raggio laser Il raggio laser eccita i vari fluorocromi che marcano i singoli spezzoni Ciascuno dei quattro fluorocromi emette una diversa lunghezza d’onda Una cellula fotoelettrica rileva sequenza, tipo ed intensità delle varie emissioni luminose ed il tutto viene registrato in forma grafica La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi; il tipo (colore del picco) corrisponde al tipo di base azotata mentre l’intensità (altezza del picco) è irrilevante

L’elettroferogramma Normalmente il sistema interpreta automaticamente l’elettroferogramma Quando l’interpretazione non è ovvia, il sistema inserisce una N al posto della base azotata mancante, questa può essere corretta manualmente, dopo lettura visiva dell’elettroferogramma, anche alla luce della sequenza del filamento complementare G

Il sequenziamento in microbiologia Identificazione Sequenziamento di regioni specie-specifiche Antibiogramma Sequenziamento di regioni in cui possono aversi mutazioni associate alla resistenza ai farmaci Filogenesi Confronto della sequenza della medesima regione in specie diverse, per ricostruirne la storia evolutiva

Identificazione mediante sequenziamento Scelta della regione da sequenziare 16S rDNA Internal transcribed spacer 23S rDNA hsp65 rpoB Sequenziamento Confronto della sequenza con quelle presenti in un database

GenBank Banca dati pubblica (in Internet) contenente circa 50 milioni di sequenze geniche delle più varie regioni di praticamente tutti gli organismi viventi Chiunque può depositare sequenze in GenBank Chiunque può confrontare la propria sequenza con tutte quelle presenti in GenBank Un motore di ricerca individua e restituisce le sequenze presenti in GenBank che hanno il più elevato grado di somiglianza con la sequenza in esame

GenBank BLAST

GenBank BLAST

GenBank, risultati

GenBank, risultati

GenBank, risultati

Le varie possibilità Identità 100% con una specie nota (ceppo di riferimento) Identità 100% con un ceppo (non di riferimento) appartenente ad una specie nota Identità 100% con una sequenza non appartenente a specie conosciute Identità <100% Verifica delle discordanze ed eventuale correzione della sequenza e, se confermate: Nuovo sequevar Nuova specie

Conclusioni Sequenziamento: Problematiche legate ai database Metodo di riferimento Sistema aperto Problematiche legate ai database La scelta fra le identificazioni proposte