Mutazioni dinamiche Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)

Circa il 2% della popolazione ha un IQ<70 (ritardo mentale) il 15-20% di tutti I ritardi mentali sono attribuibili a geni del cromosoma X Il ritardo mentale legato al cromosoma X (XLMR) è geneticamente eterogeneo con 202 loci responsabili di forme che si sovrappongono clinicamente 46 geni sono stati a tutt’oggi identificati il locus che contribuisce alla frazione maggiore causa la sindrome di Martin-Bell, oggi nota come sindrome dell’X fragile

X fragile ritardo mentale: IQ tra 20 e 70 deficit di memoria a breve termine di informazioni complesse ritardo nel linguaggio ridotte abilità visuo-spaziali ipersensibilità agli stimoli iperattività con deficit di attenzione comportamento autistico Macrocefalia con fronte, mento e orecchie sporgenti Macroorchidismo (<30ml) dopo la pubertà Anomalie connettivali: prolasso della mitrale, lassità articolare, piede piatto Disfunzioni ipotalamiche?

Nel 1969 Lubs osservò una costrizione (marker X) sul braccio lungo del cromosoma X in quattro maschi affetti e tre carriers obbligate della stessa famiglia

Il sito fragile a Xq27.3 rottura o costrizione dei cromosomi in metafase che insorge quando le cellule sono esposte ad una perturbazione della replicazione del DNA siti fragili sono su tutti i cromosomi e prendono il nome della banda cromosomica, es fra(X)(q27.3) la nomenclatura HUGO chiama questo sito FRAXA, cioè il primo sito fragile identificato sul cromosoma X

Segregazione, paradosso di Sherman Il 20% dei maschi che portano l’allele mutato sono normali (NTM) Il 30% delle carrier presenta ritardo mentale perché non è affetto? 1 I perché è affetta? 1 2 4 3 II 1 Segregation fragile X expansion III 1 2 3 4 5 IV

Fragile X syndrome

Il gene FMR

200 CONTROLS PREMUTATIONS 150 100 50 Zhong et al. Am J Hum Genet 1995 Zhong and Brown, AGG interruptions in normal and PM

Normal alleles : Premutation : Full mutation : CpG island/5 ’UTR FMR1 gene Eag I EcoRI probe EcoRI 2.4kb 2.8kb Normal alleles : Stable in the family and in the individual Unstable in the population (Polymorphism) (CGG) ~ 6 to 50 (CGG) 59 to ~ 200 Premutation : Unstable in the family Stable in the individual (CGG) > 250 Full mutation : Unstable in the individual (somatic mutations) Repress FMR1 transcription Methylation

Premutazioni e mutazioni Le premutazioni si espandono quando sono trasmesse dalla madre La donna con premutazioni ha un maggiore rischio di menopausa precoce POF (premature ovarian failure) Il più corto allele descritto che in una sola generazione è diventato mutazione piena è di 59 triplette Espansione stabile (CGG)9-AGG-(CGG)9-AGG-(CGG)9 Ha almeno 2 A che interrompono la serie di 9 triplette Espansione instabile (CGG)9-(CGG)9-(CGG)9- (CGG)9…… NON ha A che interrompono la serie

Il gene FMR1 (fragile X mental retardation 1) è all’interno di deserto genico: quindi il fenotipo NON è da geni contigui Mutazioni puntiformi o delezioni di FMR1 causano un fenotipo identico alle espansioni e questo dimostra che il ruolo del gene non è importante nelle prime fasi dello sviluppo, quando le triplette non sono ancora metilate

cosa fa FMR1? FMRP una RNA-binding protein selettiva associata con i poliribosomi ed espressa nei neuroni nelle spine dendritiche regola la traduzione degli mRNA, funzione cruciale per la plasticità sinaptica e la maturazione neuronale interagisce con gli mRNA e con il pathway dei miRNA Nell’X fragile le spine dendritiche sono immature e lunghe Cerebral Cortex, Vol. 10, No. 10, 1038-1044, October 2000

Spine dendritiche nel neocortex lunghe ed immature anche nel topo KO As already mentioned, the main phenotypic trait of Fragile X syndrome is mental retardation. Other typical features are enlarged testis in almost all affected males, and often a characteristic facial phenotype with long face, prominent forehead and large inverted ears. Patients also have behavioural problems, they are often hyperactive and show poor interpersonal contact. Postmortem examination of the brains of some fragile X patients has shown that the only consistent difference in their brain architecture are abnormally developed dendritic spines of neurons, which are observed in different regions of the brain. When compared with the normal structures, those spines appear too long, thin and also slidely more numerous. Dendritic spines are the major sites of synaptic input one neuron gets from another and therefore it seems likely that this abnormality is the structural basis underlying mental impairment in fragile X patients. Abnormal dendritic spines have been also found in the FMR1 KO mouse.

Malattie da triplette ripetute Disease Gene Locus/Protein Repeat Location Fragile X syndrome Fragile XE syndrome Friedreich ataxia Myotonic dystrophy 1 Myotonic dystrophy 2 Spinobulbar muscular   atrophy Huntington disease Dentatorubralpallidoluysian  atrophy SCA type 1 SCA type 2 SCA type 3 (Machado-Joseph disease) SCA type 6 SCA type 7 SCA type 8 SCA type 12 Xq27.3/FMR-1 protein Xq28/FMR-2 protein 9q13-9q21.1/frataxin 19q13/myotonic dystrophy   protein kinase 3q21 Xq13-Xq21/androgen receptor 4p16.3/huntington 12p13.31/atrophin-1 6p23/ataxin-1 12q24/ataxin-2 14q32.1/ataxin-3 19p13/a-1A (voltage-ependent   calcium channel subunit) 3p12-3p13/ataxin-7 13q12/none identified 5q31-5q33 CGG GCC GAA CTG CCTG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CTG CAG Noncoding Noncoding Noncoding Noncoding Noncoding Coding Coding Coding Coding Coding Coding Coding Coding ? Noncoding

Malattie da triplette ripetute non codificanti

anticipazione nella distrofia miotonica

Malattie da triplette ripetute di poliglutammina

la Huntingtina con poliglutammina forma aggregati nei neuroni causandone la morte all'inizio sintomi psichiatrici quali depressione, irritabilità, difficoltà a prendere decisioni, poi presenta movimenti incontrollati simili a una danza e demenza pur con una grande variabilità individuale, la malattia avanza inesorabilmente fino alla morte tentativi terapeutici sono in corso con la cistamina che inibisce la transglutaminasi coinvolta nella formazione degli aggregati Huntington's Disease. Neurons of patients with Huntington's disease contain one copy of the wild-type huntingtin allele (producing orange protein) and one copy of the mutant allele (producing orange and blue protein). Possibly as part of the normal proteolysis of huntingtin, an N-terminal fragment is generated. Mutant N-terminal fragments accumulate and aggregate, forming neuronal intranuclear inclusions. Nuclear translocation of mutant N-terminal fragments up-regulates transcription of caspase 1. As the disease progresses, caspase 1 activates caspase 3. Caspase 1 and caspase 3 cleave huntingtin, producing N-terminal fragments and resulting in the depletion of huntingtin. As the disease progresses further, Bid is activated, releasing cytochrome c. Assembly of the apoptosome activates caspase 9 and caspase 3. Progressive caspase activation leads to neuronal dysfunction and cell death.

Caratteri complessi Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)

un carattere non Mendeliano ha una componente genetica? i genitori trasmettono i geni l’ambiente (questo vale specialmente per caratteri quali IQ e i disordini psichiatrici) anche le abitudini alimentari, il clima, ecc. Occorre provare il ruolo dei geni al di là della ricorrenza familiare

geni condivisi gemelli monozigoti 1/1 consanguineità fratelli, genitori-figli fratellastri, zii-nipoti cugini I grado cugini II grado 1/1 consanguineità 1/2 consanguineità 1/4 consanguineità 1/8 consanguineità 1/32 consanguineità

gemelli monozigoti MZ hanno lo stesso sesso hanno gli stessi alleli hanno gli stessi polimorfismi se femmine, hanno un differente pattern di inattivazione dell’X hanno un differente repertorio di immunoglobuline hanno un differente TCR spesso hanno un ambiente più simile

gemelli dizigoti DZ hanno lo stesso sesso nel 50% dei casi hanno il 50% degli alleli in comune hanno il 50% dei polimorfismi in comune Occorre considerare il rapporto MZ/DZ che può essere inferiore a 2 o superiore a 2 in funzione del numero dei geni coinvolti

Analisi nonparametrica Senza un modello Non si sa a priori se la trasmissione è dominante o recessiva o mista o poligenica, ecc Si valuta quanta parte si condivide dei segmenti di DNA nelle famiglie o nelle popolazioni

Studi di associazione Sono diventati il metodo migliore per identificare fattori di rischio per malattie complesse Più potente del linkage se le varianti che conferiscono suscettibilità sono comuni, mentre è meno potente se le varianti sono rare È necessario procedere con una mappa che comprende molti marcatori a breve distanza l’uno dall’altro

usare SNPs comuni Associazione indiretta Gli SNPs sono genotipizzati sulla base del linkage disequilibrium (LD)

Infinium, Illumina Infinium HD BeadChip Markers (per sample) Median Marker Spacing Human1M-Duo >1.1 million 1.5kb Human660W-Quad >658,000 2.5kb HumanCytoSNP-12 ~300,000 10kb Human510S-Duo* >510,000 3.2kb Infinium, Illumina

GWA (genomic wide association) studies GWAs servono a comprendere la base genetica dei tratti complessi Per alcuni tratti ci sono molti loci: diabete, cancro della prostata e della mammella, malattia infiammatoria intestinale, ecc Per altri tratti i loci sono pochi: asma, malattia coronarica, fibrillazione atriale A Catalog of Genome-Wide Association Studies http://www.genome.gov/26525384

punti critici dei GWAs Selezione dei casi Selezione dei controlli minimizzare l’eterogeneità fenotipica? focalizzazione su casi familiari? scegliere casi ad insorgenza precoce? Selezione dei controlli Controlli comuni a differenti tratti? 3000 controlli della Wellcome Trust Case Control Consortium Significatività statistica p < 5 x 10–8 Replica dello studio

Tremore 02/25/09 Stefansson February 01, 2009 Nat Genet Variant in the sequence of the LINGO1 gene confers risk of essential tremor Essential tremor 452 cases 14,378 controls 15q24.3 LINGO1 1 x 10-9 Illumina [305,624]

obesità 01/15/09Thorleifsson December 14, 200Nat Genet Genome-wide association yields new sequence variants at seven loci that associate with measures of obesity Body mass index Studio iniziale: 80,969 individuals Replica: 11,036 individuals 16q12.2 FTO 1 x 10-47 2p25.3 TMEM18 4 x 10-17 16q12.2 18q21.32 19q13.11 1p31.1 3q27.2 16p11.2 11p14.1 11p14.1 1q25.2 12q13.13 1p21.3 11p14.1 FTO MC4R KCTD15, CHST8 NEGR1 SFRS10, ETV5, DGKG SH2B1, ATP2A1 BDNF BDNF SEC16B, RASAL2 BCDIN3D, FAIM2 NR BDN 4 x 10-13 1 x 10-12 7 x 10-12 1 x 10-11 7 x 10-11 3 x 10-10 5 x 10-10 9 x 10-10 6 x 10-8 1 x 10-7 4 x 10-6 8 x 10-6 8.04 [6.96-9.12] % SD 6.12 [4.69-7.55] % SD 5.25 [3.82-6.68] % SD 4.38 [3.16-5.60] % SD 4.18 [2.98-5.38] % SD 3.77 [2.67-4.87] % SD 4.42 [3.09-5.75] % SD 3.63 [2.49-4.77] % SD 4.58 [3.07-6.09] % SD 3.85 [2.62-5.08] % SD 3.36 [2.14-4.58] % SD 3.28 [2.06-4.50] % SD 2.6 [1.50-3.70] % SD 3.15 [1.78-4.52] % SD Illumina [305,846]

Aneurismi intracranici Bilguvar November 09, 2008 Nat Genet Susceptibility loci for intracranial aneurysm in European and Japanese populations 1,580 European cases, 6,276 European controls 495 Japanese cases, 676 Japanese controls 8q11.23 SOX17 1 x 10-10 9q21.3 CDKN2A CDKN2B 1 x 10-10 Illumina [289,271]

Manhattan plot GWA Diabete di tipo 2 Crom 10 TCF7L2 transcription factor 7-like 2 Crom 16 FTO fat mass and obesity associated Crom 6 CDKAL1 = CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1