Metodi di Indagine Strutturale di Biomolecole Prof Metodi di Indagine Strutturale di Biomolecole   Prof. Mario Piccioli Centro Risonanze Magnetiche (stanza 41) Polo Scientifico Via L. Sacconi 6, Tel: 055-4574265 piccioli@cerm.unifi.it

Outline Spettroscopia NMR Cristallografia Raggi X Spettrometria di Massa …..che cosa sono? …..perché dovrei sapere qualcosa di queste tecniche? …in che occasione potrebbero servirmi? ….dove potrei andare per utilizzarle? …

Perché conoscere i metodi strutturali?

The model

Nobel laureates 1962 Wilkins, Perutz, Crick, Steinbeck, Watson, Kendrew

Perutz (Haemoglobin), Kendrew (Myoglobin)

From genome to structure. From structure to function ....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc tgcctcctac aactagacaa gtcacaatgc aacccctttg ctccagagga aaaggagtaa gcacagaggg cttctgagtc cggcaatgct ccatttcctg acaggagcat tttacagact tgcgtctgcc cctctgaggg ... From: Prof. Anna Tramontano

Biomolecular Structures

New folds per year

NMR vs XRay

Molecule type Protein DNA RNA Protein-DNA complexes 1200 55000 750 2500 RNA Protein-DNA complexes

Strumenti per la Biologia strutturale Structural Tools

SPETTROSCOPIA di RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE Che si puo’ fare con NMR? -Strutture di proteine di peso molecolare fino a 40000 -Interazioni proteina-proteina oppure proteina-legante, oppure enzima-substrato -Dinamica di proteine -Relazione struttura-funzione -Fenomeni cinetici. Reazioni. Scambio chimico -Protein folding -Reattività

Di che cosa abbiamo bisogno? PRINCIPI DI BASE Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B0 Un trasmettitore di radiofrequenza

Ripasso. Struttura dell’atomo Gli atomi sono costituiti da un nucleo positivo e da elettroni negativi. Il nucleo ha un raggio di 10-5 Å. Il raggio di un atomo è dell'ordine di 1 Å.

Ripasso.Nuclidi X A Z Un nuclide è un atomo caratterizzato dal numero atomico Z (numero di protoni) e dal numero di massa A (numero di neutroni e di protoni). Il nuclide neutro ha un numero di elettroni uguale a quello di protoni. Il numero Z caratterizza la specie atomica. H 1 C 12 6 O 16 8

Isotopi Nuclidi con lo stesso Z ma differente A possono esistere e si chiamano isotopi. Una stessa specie atomica ha, di norma, diversi isotopi: si parla di miscela isotopica naturale. C 12 6 C 13 6 C 14 6

Isotopi naturali di alcuni elementi Nuclide Massa relativa % di nuclidi 1H 1,007825 99,985 2H 2,014102 0,015 3He 3,016030 ~ 10-4 4He 4,002604 ~ 100 6Li 6,015126 7,42 7Li 7,01605 92,58 9Be 9,012186 10Be 10,013535 tracce 10B 10,012939 19,6 11B 11,009305 80,4 11C 11,011433 12C 12, 98,89 13C 13,003354 1,11 14C 14,003142

Proprietà magnetiche delle particelle subatomiche Ogni protone ed ogni neutrone possiede un numero quantico di spin I= +-1/2, in analogia alla situazione che voi già conoscete per gli elettroni. Ad ogni nucleo sarà associato un numero quantico di spin nucleare che è la somma di tutti i numeri di spin dei nucleoni. Analogamente agli elettroni, i nucleoni tendono ad “appaiare” lo spin. Tutti gli isotopi con un numero dispari di PROTONI O DI NEUTRONI nucleoni hanno un numero quantico di spin I≠0. Per i nucleoni piu’ pesanti, la regola di “massimo appaiamento” non è sempre verificata, per cui alcuni isotopi hanno numero quantico di spin >1/2. Alcuni nucleoni con numero di massa pari possiede I=1,2,3.. Mentre alcuni isotopi con numero di nucleoni dispari possiede I=3/2, 5/2, 7/2..

Ovvero possono essere studiati via NMR Nuclei NMR-attivi Tutti i nuclidi con un numero quantico di spin nucleare I diverso da zero sono NMR attivi, Ovvero possono essere studiati via NMR Per i piu’ comuni studi NMR vengono utilizati solo quei nuclidi con spin nucleare I=1/2

Spin nucelare e nuclidi Protoni Neutroni I pari pari 0 dispari dispari 1,2,3 dispari pari ½,3/2, 5/2, 7/2 pari dispari ½,3/2, 5/2, 7/2

NMR e tabella periodica Su questa base, quasi tutti gli elementi avranno almeno 1 isotopo NMR attivo C 12 6 C 13 6 C 14 6 98,9 % 1,11 % tracce

Esercizio

NMR-active nuclei with different spin numbers

NMR-active nuclei with different spin numbers 11H, 21H, 42He, 126C, 136C, 147N, 157N, 168O, 178O, 199F, 2311Na, 2713Al 3115P, 3517Cl, 5426Fe

NMR-active nuclei with different spin numbers 42He, 126C, 168O, 5426Fe 11H, 136C, 157N, 178O, 199F, 2311Na, 2713Al 3115P, 3517Cl, 21H, 147N,

NMR-active nuclei with different spin numbers I=1/2 11H, 136C, 3115P, 199F, 157N I=3/2 2311Na 3517Cl I=5/2 178O 2713Al

Di che cosa abbiamo bisogno? PRINCIPI DI BASE Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B0 Un trasmettitore di radiofrequenza

Momento Magnetico B0 m m=gI m Ad un numero quantico di spin I è sempre associato un momento magnetico di spin m m B0 m=gI m Un momento magnetico può essere considerato come una piccola calamita. Come tale, se immersa in un campo magnetico, essa puo’ orientarsi in modo parallelo o antiparallelo al campo magnetico applicato esterno.

Momento Magnetico B0 m m=gI m Ad un numero quantico di spin I è sempre associato un momento magnetico di spin m m B0 m=gI m Il rapporto giromagnetico g è una costante di proporzionalità tra il numero quantico di spin ed il momento magnetico. In pratica, due nuclidi con stesso valore di I (es: 11H e 136C) hanno un diverso momento magnetico perché ogni nuclide ha un proprio valore di g.

Momento Magnetico B0 B0 I= spin quantum number Più esattamente, ad ogni numero quantico di spin I è associato un numero quantico magnetico m, che puo’ assumere valori da +I a –I I= spin quantum number m= Magnetic quantum number (-I…+I) m= - ½, + ½, m= -1, 0,+1 I= ½ I= 1 m=-1/2 m=-1 m=0 B0 B0 m=+1/2 m=+1

L’energia della transizione NMR B0 Il campo magnetico B0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli I due livelli energetici sono degeneri se B0=0

L’energia della transizione NMR B0 Il campo magnetico B0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli I due livelli energetici sono degeneri se B0=0

Magnetizzazione osservabile

Magnetizzazione osservabile

Magnetizzazione osservabile

Magnetizzazione osservabile

Momento Magnetico Il momento magnetico non è un oggetto statico, ma puo’ essere descritto come una trottola, che possiede una certa velocità angolare , tipica di ogni spin

Momento Magnetico E=-m •B0 L’energia di ogni spin è data, in termini fisici, dal prodotto scalare tra il campo magnetico applicato B0 ed il momento magnetico della particella m

Momento Magnetico E=-mħg B Questo prodotto scalare dipende dall’orientazione del momento magnetico rispetto a B0. Per effetto delle regole di quantizzazione dell’energia, esso dipende dal numero quantico di spin nucleare m, che puo’ essere +1/2 oppure -1/2

Momento Magnetico E=-mħg B Questo prodotto scalare dipende dall’orientazione del momento magnetico rispetto a B0. Per effetto delle regole di quantizzazione dell’energia, esso dipende dal numero quantico di spin nucleare m, che puo’ essere +1/2 oppure -1/2

Momento Magnetico m=+1/2 m=-1/2 E=+1/2ħg B E=-1/2ħg B

Momento Magnetico E=+1/2ħg B E=-1/2ħg B m=+1/2 m=-1/2 Stato eccitato Meno popolato Stato fondamentale Più popolato

La frequenza di precessione di Larmor Ogni momento magnetico precede intorno al campo magnetico statico B0 Spin equivalenti precedono tutti con la stessa velocità w0 anche se ciascuno con una fase diversa a: m = +½ ma = +½g Ea = -½gB0 B0 E = -mB0 E = -gmB0 equivalenti significa nuclidi di atomi identici b: m = -½ mb = -½g Eb = +½gB0 CH3CH2OH

La frequenza di precessione di Larmor Poiche il numero dei momenti magnetici allineati con il campo magnetico é leggermente maggiore di quelli anti allineati la risultante é un vettore magnetizzazione M allineato lungo l’asse z a: m = +½ ma = +½g Ea = -½gB0 B0 M0 M0 = Sm = Mz Mx = My = 0 E = -mB0 E = -gmB0 La differenza tra le due popolazioni é tanto maggiore quanto piu’ elevata e la differenza di energia tra i due livelli b: m = -½ mb = -½g Eb = +½gB0

La frequenza di precessione di Larmor La differenza di energia,(Eb-Ea), dipende dal tipo di nucleo (ogni nuclide a un diverso valore di g) e dal campo magnetico applicato a: m = +½ ma = +½g Ea = -½gB0 B0 E = -mB0 E = -gmB0 DE = gB0 = w0 = hn0 La differenza di energia é anche legata alla frequenza di precessione, ovvero alla velocità angolare con cui tutti I nuclidi equivalenti ruotano intorno a B0 b: m = -½ mb = -½g Eb = +½gB0

Il rapporto giromagnetico mz=gIz =g(h/2p)mz Non tutti gli isotopi con I=1/2 hanno le stesse proprietà magnetiche Il momento magnetico è diverso per ogni isotopo e dipende dalla costante g DE=g(h/2p)B0 Tanto maggiore è g, tanto piu’ alta sarà la differenza di energia tra i 2 livelli della transizione NMR. Ovvero tanto maggiore sarà la sensibilità dell’esperimento

Magnetizzazione osservabile Mo

La risonanza magnetica nucleare A parità di campo magnetico, la differenza di energia varia al variare del nuclide, pertanto nuclei come 1H e 13C hanno diverse energie di transizione e, di consequenza, diverse FREQUENZE DI RISONANZA La frequenza di risonanza di ciascun nuclide é chiamata Frequenza di Larmor

La risonanza magnetica nucleare Per poter fare un esperimento NMR si dovrà irradiare il campione da studiare con una radiazione elettromagnetica di energia corrispondente alla FREQUENZA DI RISONANZA Questo farà si che i nuclidi siano eccitati L’effetto della eccitazione ed I fenomeni che seguono negli istanti successivi, danno luogo ad una emissione di frequenze da parte del campione in esame

L’energia della transizione NMR E= -m•B0 m=-1/2 DE=h0 DE=g(h/2p)B0 E m=+1/2 Larmor Frequency B0 I due livelli energetici sono degeneri se B0=0 Il campo magnetico B0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli

A che serve il campo magnetico B0 ? Riassumendo A che serve il campo magnetico B0 ? Il campo magnetico B0 serve a generare la differenza di popolazione tra i 2 livelli di spin nucleare. La consequenza di questa differenza di energia é l’esistenza di una magnetizzazione risultante che, in condizioni di equilibrio, é orientata lungo la direzione del campo magnetico B0 Tanto piu’ il campo magnetico B0 è intenso, tanto piu’ è intensa la magnetizzazione risultante, tanto maggiore è la sensibilità dell’eseprimento NMR.

Il campo magnetico Magnete a 400 MHz Magnete a 900 MHz Costo commerciale di uno spettrometro as 900 MHz: ca. 5 M€ n. Di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10

The Magnet History First magnets were built using ferromagnetic material= permanent magnet Then Electromagnets: i.e. field was generated by wiring of conducting material Now: cyomagnets: i.e. electromagnets made of superconducting wire. A “cutted” magnet

IMPORTANTE Cosa è, per esempio, uno spettrometro a 500 MHz? E’ uno strumento che, per creare la differenza di energia tra i due livelli di spin nucleare, utilizza un campo magnetico B0 tale per cui la differenza di energia, calcolata per lo spin 1H, tra il livello fondamentale e quello eccitato DE=hn è pari a 500X106 Hz

Esercizio Calcolare la frequenza di un segnale NMR

Esercizio DE=g(h/2p)B0 DE=hn0 n0(2p) = gB0 If B0 is 11,75 T the investigated nucleus is 1H DE=hn0 g=2,675 x108 rad s-1 T-1 2,675*108*11,75=34,43*108 s-1 rad n0(2p) = gB0 34,43*108 s-1 rad /2p=500,28*106 s-1 =500 MHz

Di che cosa abbiamo bisogno? PRINCIPI DI BASE Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B0 Un trasmettitore di radiofrequenza

Prodotto vettoriale

Esperimento NMR Per descrivere gli esperimenti NMR, il metodo piu’ comune è quello di vedere l’insieme degli spin descritto fino ad adesso come la magnetizzazione somma, ovvero come un singolo vettore magnetizzazione (ogni atomo chimicamente diverso avrà il suo proprio vettore). Se immerso in un campo magnetico B0, il vettore è allineato lungo l’asse z. z B0 y x

Esperimento NMR Per perturbare il sistema si irradia il campione con una radiofrequenza la cui frequenza è esattamente corrispondente alla frequenza di Larmor. Per descrivere l’esperimento in modo piu’ semplice, si utilizza, al posto del sistema di riferimento di laboratorio, un sistema di riferimento ruotante (rotating frame) la cui frequenza è proprio quello della frequenza di Larmor. Il vantaggio è che, in tale sistema di riferimento la frequenza di irradiazione puo’ essere vista come un campo magnetic statico (diverso dal campo magnetico stazionario B0) che chiameremo B1. z B0 y x

x y time z z’ = z B0 M M y y’ –w0 w0 +w0 2w0 x x’ LAB. ROTATING (neglected) –w0

Sistema ruotante A pulse!

Sistema di laboratorio Fly A (Laboratory Frame) jam The movement of Fly B as seen by Fly A Fly B Sistema ruotante jam Fly B The movement of Fly B as seen by Fly A Fly A (Rotating frame)

Esperimento NMR dm/dt=m(t)^B1(t) Nel sistema ruotante il vettore magnetizzazione del campione, orientato lungo l’asse z, viene perturbato da una campo magnetico B1 che, nel rotating farme, risulta nel piano x y allineato lungo un asse. L’effetto di questa radiazione B1 è quella di ruotare il vettore magnetizazione, sulla base del prodotto vettoriale. z z B0 B0 y y x x dm/dt=m(t)^B1(t) B1 Prodotto vettoriale

Esperimento NMR dm/dt=m(t)^B1(t) L’effetto è che, quando si applica B1, la magnetizzazione ruota secondo le regole del prodotto vettoriale (regola della mano destra) allontanandosi da z e ruotando verso l’asse -y (se il vettore B1 è applicato lungo x) . z z B0 B0 y y x x dm/dt=m(t)^B1(t) B1 Prodotto vettoriale

Esperimento NMR Consideriamo solo un singolo spin. Per esempio un campione contenente solo H2O Lo stato del sistema all’equilibrio Ovvero: campione nel campo magnetico, prima di fare l’esperimento

Esperimento NMR L’effetto di un IMPULSO è di portare il sistema fuori dall’equilibrio La magnetizzazione di H2O è ruotata. Tanto piu’ lungo è l’impulso applicato tanto maggiore sarà la rotazione

Importante Il segnale osservato nell’esperimento NMR è il segnale che si trova sul piano xy

Esperimento NMR IMPULSO a 90° IMPULSO a 180°

The NMR Experiment z y x M B1 90° t wI I t To have a spin transition, a magnetic field B1 , oscillating in the range of radiofrequencies and perpendicular to z, is applied (perturbing pulse) The B1 field creates coherence among the spins (they all have the same phase) and net magnetization in the x,y plane is created After the pulse is switched off, the magnetization precesses in the xy plane and relaxes to equilibrium z y x M B1 90° t wI I t The current induced in a coil by the magnetization precessing in the xy plane is recorded. It is called FID.

Segnale ricevuto My=exp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation n=0 Se la radiofrequenza applicata è esattamente la frequenza di Larmor, si osserva nel tempo un segnale che tende a decadere (vedi dopo). Questo segnale è confrontato con la frequenza del rotating frame e la frequenza di risonanza del segnale è proprio quella del rotanting frame Il fatto che il segnale deacde dipende da un meccanismo, chiamato rilassamento, che saraà discusso in seguito My=exp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation n=0 Frequency (n)

Segnale ricevuto My=cos(nobs)texp(t/T2) Se invece la magnetizzazione che studiamo ha una frequenza di risonanza diversa da quella dell’impulso di eccitazione, si osserverà un segnale alla frequenza nobs=(n1-n0) My=cos(nobs)texp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation n=0 n=nobs Frequency (n)

Sensibilità dell’Esperimento NMR S/N  N g5/2 B03/2 N = Numero di spins che contribuiscono al segnale g rapporto giromagnetico del nuclide studiato B Camp magnetico utlizizzato

Alcuni dati da ricordare Tutti i nuclidi con I diverso da =0 possono essere studiati attraverso spettroscopia NMR I piu’ importanti, per lo studio di molecole d interesse biologico sono 1H, 13C, 15N, 31P Abbondanza naturale e la frequenza di risonanza sono importanti per determinare la sensibilità di un esperimento NMR 1H è il nucleo piu’ studiato via NMR. PERCHE’: i) la sua abbondanza isotopica è vicina al 100% ii) E’ il nucleo con la frequenza piu’ alta 13C è il secondo nucleo piu’ studiato via NMR. PERCHE’: i) la sua abbondanza isotopica è circa 1% ii) E’ un nucleo con la frequenza relativamente alta, (1/4 rispetto ad 1H)

Alcuni dati da ricordare Esperimento NMR: Il campo magnetico statico B0 serve per generare la transizione energetica Il campo magnetico B1 serve per emettere una radiazione che stimola la transizione. Senza la radiazione del campo B1 il sistema è in condizioni di equilibrio e quindi non vi è nessun fenomeno spettroscopico. Solo la eccitazione del sistema permette di effettuare misure spettroscopiche

Alcuni dati da ricordare Il campo magnetico B0 è espresso in Tesla. Esso è determinato dal magnete a disposizione e si mantiene costante nel tempo La energia della transizione NMR è espressa in s-1. L’ordine di grandezza è quello delle onde radio (90-1000 MHZ) Un trasmettitore di radiofrequenze genera il campo magnetico B1 che permette la transizione NMR. Quindi il campo magnetico B1 rimane acceso solo per effettuare la transizione. Il campo magnetico B1 genera IMPULSI.

Domanda Quale è la energia della transizione 13C rispetto a quella di 1H? Se in un campo magnetico la frequenza di Larmor di 1H è 500 MHz, quale sarà la frequenza di 13C? E di 15N? Se la sensibilità di un esperimento è il prodotto della Concentrazione X la energia della transizione Quale è la sensibilità relativa di uno spettro di 13C rispetto ad uno spettro 1H?

Segue….. Tu che sei un biotecnologo, cosa potresti fare per migliorare la Sensibilità di questo esperimento?