Esperienze eseguite nel laboratorio ARPACAL. Istituto Tecnico Statale Per Attività Sociali “Bruno Chimirri” - Catanzaro PROGRAMMA OPERATIVO NAZIONALE 2007-2013 “Competenze per lo Sviluppo” - 2007 IT 05 1 PO 007 F.S.E. Codice Progetto: C-5-FSE-2013-109 “L’oliva: dalla ricchezza nutrizionale alla validità ambientale” Esperienze eseguite nel laboratorio ARPACAL.

Parametri di qualità di un olio La normativa CEE per valutare il livello di ossidazione di un olio di oliva ha previsto due determinazioni: Numero di perossidi: misura il livello dei prodotti primari di ossidazione (idroperossidi) e quindi dell' irrancidimento. Tali prodotti non sono rilevabili all'esame organolettico. Esame spettrofotometrico nell'ultravioletto: permette la misurazione a 232 nm, del livello dei prodotti primari di ossidazione e a 270 nm, del livello dei prodotti secondari di ossidazione (composti carbonilici) che si originano per degradazione degli idroperossidi e che conferiscono il difetto di rancido all'olio.

Le frodi dell’olio Il nostro olio è spesso soggetto a falsificazioni. Le frodi maggiormente ricorrenti ai giorni nostri riguardano soprattutto le diverse classificazioni, cioè oli di classe inferiore vengono venduti come prodotti di classe superiore, per esempio mediante una rettificazione. La rettificazione, impropriamente detta raffinazione, comprende una serie di trattamenti chimici e fisici, atti a rendere commestibili oli chimicamente alterati ed inadatti all’alimentazione per caratteri organolettici indesiderabili. Ma l'analisi chimica e fisica degli oli ha raggiunto livelli notevoli, permettendo così di stabilire, con assoluta certezza, se siano state compiute frodi. Anche quelle più sofisticate non possono infatti sfuggire, oggi, ai controlli effettuati per mezzo di apparecchi perfetti quali il gas-cromatografo e lo spettrofotometro.

Metodi analitici conducibili su un campione di olio Titolazione: il metodo chimico di determinazione dell'acidità si basa su una titolazione acido/base mediante soluzione di idrossido di potassio, mentre quello per la determinazione del numero di perossidi si basa su una titolazione ossido-riduttiva mediante soluzione di tiosolfato di sodio. Spettrofotometria U.V.: da test spettrofotometrici si traggono per l'olio importanti informazioni sulla qualità dei grassi componenti, sullo stato di conservazione e sulle modificazioni indotte dai processi tecnologici e di estrazione. Analisi gascromatografica degli acidi grassi :tipi, quantità, isomeri trans.

TITOLAZIONE

Acidità libera ACIDO OLEICO CHE COS’E’: parametro per stabilire la qualità di un olio di oliva. E’ espressa come percentuale di acido oleico anche se è dovuta a numerosi composti. La presenza elevata di questi acidi grassi liberi (superiori al 3-4%) rende un olio non commestibile poiché avrebbero un'azione irritante sulla mucosa gastroenterica GLI ACIDI LIBERI derivano come prodotto di alcune reazioni innescate da enzimi lipolitici, durante la maturazione del frutto o a causa di una cattiva conservazione del frutto. SU CHE COSA SI BASA L’ANALISI Titolazione acido-base effettuata in soluzione organico con idrossido di potassio come titolante e fenolftaleina come indicatore. ACIDO OLEICO

Reattivi: Campione di olio di cui si vuole conoscere l’acidità Idrossido di potassio sol. 0.1 M Etere etilico Alcool etilico assoluto Fenolftaleina sol. 0.1 % Apparecchiatura: Buretta da 25 mL Vetreria. Procedimento operativo Si pesano accuratamente su bilancia analitica, in una beuta da 250 mL, una quantità in grammi di olio in esame che dipende dal grado di acidità presunto. In un cilindro graduato si prepara una miscela 1:3 di alcool etilico ed etere etilico e la si travasa in una seconda beuta da 250 mL. Si prepara la buretta sul suo sostegno versando in essa la soluzione di idrossido di potassio 0.1M, e si azzera. Si prende la beuta contenente 10-20 ml della miscela alcool - etere e ad essa si aggiungono 1-2mL di fenolftaleina; poiché la miscela risulta debolmente acida è necessaria neutralizzarla con alcune gocce di soluzione di KOH, fatte defluire dalla buretta, fino a evidente colorazione violetta. Si riazzera la buretta, si travasa la miscela prima preparata nella beuta contenente l'olio d'oliva, si agita per alcuni secondi al fine di rendere omogeneo il tutto, che, per la presenza degli acidi grassi, ritorna incolore. Si dà inizio alla titolazione.

Espressione dei risultati: Il risultato può essere espresso sia in termini di “numero di acidità” sia in termini di % di acido oleico, secondo le seguenti equazioni: numero di acidità = V ⋅ M ⋅56,1 % AcidoOleico = V ⋅ M ⋅ 28,2 P P dove: V = mL di soluzione di KOH usati, M = molarità della soluzione di KOH P = massa in g dell'olio. La reazione di neutralizzazione che avviene, riferita all'acido oleico può essere così schematizzata: CH3(CH2)7CH = CH(CH2)7COOH + KOH →CH3(CH2)7CH = CH(CH2)7COOK + H2O RISULTATI OTTENUTI

A + 2I-  B + I2 I2 + 2S2O32-  2I- + S4O62- Numero di perossidi CHE COS’E’: esprime la quantità di ossigeno già assorbita dall'olio, il quale quindi ha già iniziato una propria attività ossidativa che durante l'invecchiamento porta ad un irrancidimento del prodotto che ne conferisce odori e sapori sgradevoli. Attraverso questa analisi possiamo quindi determinare la potenzialità ossidativa di un olio di oliva: più alto è il suo valore e più avanzato è lo stadio di irrancidimento del prodotto. CAUSE DELL’IRRANCIDIMENTO: il parametro si può alterare: Sovra maturazione delle olive e/o prolungata lavorazione esposizione del prodotto alla luce e/o ad elevate temperature; SU CHE COSA SI BASA L’ANALISI Si basa su una titolazione redox nella quale lo iodio liberato è titolato con una soluzione di tiosolfato di sodio a concentrazione nota in presenza di indicatore amido, che forma un complesso colorato con lo iodio A + 2I-  B + I2 I2 + 2S2O32-  2I- + S4O62- Oliva matura

Apparecchiatura: - ditale di vetro da 3 ml - beute a tappo smerigliato aventi capacita di 250 ml buretta da 50 ml graduata in 0,05 ml Reattivi: - cloroformio - acido acetico glaciale - ioduro di potassio, soluzione acquosa satura, di recente preparazione, esente da iodio e da iodati tiosolfato di sodio, 0,01 o 0,02, soluzione acquosa accuratamente standardizzata . salda d’amido Procedimento operativo Pesare in un ditale di vetro una massa di campione conformemente al numero di perossidi previsto. Stappare un pallone ed introdurre il ditale di vetro contenente la sostanza da analizzare. Aggiungere 10 ml di cloroformio. Sciogliere la sostanza da analizzare rapidamente, agitando. Aggiungere 15 ml di acido acetico, quindi 1 ml di ioduro di potassio. Ritappare rapidamente, agitare per 1 minuto e lasciare a riposare per 5 minuti esatti al riparo dalla luce ad una temperatura compresa tra 15 e 25 °C. Aggiungere 75 ml di acqua distillata. Titolare lo iodio liberato con una soluzione di tiosolfato di sodio agitando vigorosamente, usando la salda d’amido come indicatore. Eseguire due determinazioni sullo stesso campione di sostanza.

Espressione dei risultati: PV = VxNx100 m Il numero di perossidi viene espresso in milliequivalenti di ossigeno attivo per Kg. V = ml di soluzione di Na2S2O3 N = normalità della soluzione di Na2S2O3 m = massa in g di olio pesato

Analisi Spettrofotometrica

Analisi UV CHE COS’E’: è un procedimento di semplice esecuzione, che ha permesso di risolvere definitivamente il problema del riconoscimento dell'olio rettificato eventualmente aggiunto all'olio di oliva vergine, sfruttando il fatto che gli oli naturali di pressione non contengono doppi legami coniugati che invece si formano, sia pure in misura minima, durante la rettifica, particolarmente nella fase di decolorazione su terre attive. OBIETTIVO: valutare la genuinità dell’olio e identificare eventuali adulterazioni.

Legge di Lambert-Beer A = bC ~ A = Assorbanza = Log (Io /I) I = Intensità di emissione di una sorgente  = assorbività molare o coefficiente di estinzione molare, l’assorbanza di una soluzione 1M b = cammino ottico C = concentrazione della sostanza che assorbe la luce I0 ~ I Sorgente di emissione Rivelatore Campione b

Spettrofotometro UV-visibile Uno strumento che effettua analisi con tecniche spettroscopiche si chiama genericamente spettrofotometro ed è composto dalle seguenti parti: Il monocromatore è un sistema che permette di selezionare o filtrare le  che arrivano dopo il campione. Comparto del campione Monocromatore Rivelatore Sorgente di emissione al PC

La tecnica consiste nell’irraggiare il campione con un intervallo più o meno ampio di ; le  assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni elettroniche, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento. L'esame UV viene condotto sull'olio disciolto in opportuno solvente (cicloesano o isoottano) nell'intervallo compreso tra 220 e 280 nm. Le lunghezze d'onda più significative sono 232, 262, 268 e 274 nm. I valori di assorbimento vengono espressi come assorbanza specifica o coefficiente di estinzione molare, intendendo con questa espressione l'assorbanza ad una certa lunghezza d'onda di una soluzione all'1 % dell'olio in esame nel solvente prescelto, osservata in una cella dello spessore di 1 cm. Per quanto riguarda il solvente, il Metodo Ufficiale indica l'isoottano, mentre in passato era usato generalmente il cicloesano. Dall’osservazione del grafico si è potuto constatare che nel quarto campione preso in considerazione vi era la presenza di coloranti aggiuntivi.

CROMATOGRAFIA

Il termine cromatografia racchiude una serie di metodi analitici in grado di separare e quantificare singolarmente i diversi componenti presenti in miscele di analiti anche molto complesse. I metodi cromatografici sfruttano la tendenza delle varie sostanze a distribuirsi a seconda della diversa affinità delle molecole e degli ioni nei confronti di due fasi diverse di cui una è mantenuta fissa (fase stazionaria) e l'altra è mobile (fase mobile o eluente. La fase mobile, costituita generalmente da un fluido (liquido o gas) fluisce attraverso la fase stazionaria, costituita invece da una sostanza solida, trasportando i diversi componenti della miscela. Ognuno di tali componenti presenta una differente affinità per le due fasi, quindi migrerà ad una diversa velocità separandosi dal resto dei componenti.

Gascromatografia (GC) La gascromatografia è una delle tecniche cromatografiche che consente di: stabilire la composizione acidica qualitativa e quantitativa di qualsiasi sostanza grassa; individuare se un olio d'oliva sia extravergine o lavorato industrialmente; individuare qualunque grasso del quale sia nota con sufficiente approssimazione la composizione sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo; individuare una miscela di olio d'oliva nella quale siano presenti grassi vegetali o animali estranei. 

Esempio di cromatogramma ottenuto dall’analisi di un olio campione.

CROMATOGRAFIA SU COLONNA

Tecnica dell’analisi cromatografica COS’E’ LA CROMATOGRAFIA SU COLONNA? Tecnica dell’analisi cromatografica OBIETTIVO Permette di isolare le sostanze in base alla loro diversa affinità con sostanze più o meno polari. STRUMENTAZIONE Consiste di un tubo di vetro chiamata colonna nel quale sono poste sostanze chimiche nelle due fasi: la fase stazionaria: è rappresentata dal gel di silice; la fase mobile: soluzione di etere- petrolio e acetone secondo un rapporto 4:1. Le sostanze da estrarre isolare presenti nelle foglie di oliva sono fondamentalmente di due tipi: a) Il Beta-Carotene, colorato in giallo/arancio; b) La Clorofilla nelle forme molecolari di clorofilla A e B,che presenta un'intensa colorazione verde;

BETACAROTENE CLOROFILLA B CLOROFILLA A

HPLC: RICERCA DEL α - TOCOFEROLO

I tocoferoli nell’olio L’ alfa-Tocoferolo è un costituente della vitamina E, dotato di un forte potere antiossidante soprattutto verso gli acidi grassi polinsaturi che sono i più propensi ad ossidarsi.

ANTIOSSIDANTI Sostanze che ostacolano l’ossidazione delle varie strutture dell’organismo ad opera dell’ossigeno e dei suoi derivati prevenendo l’insorgenza di tumori. Rimuovono i radicali liberi intermedi e impediscono la continuazione della reazione di propagazione. I radicali ossidati di α-tocoferossile prodotti in questo processo possono essere riportati alla forma ridotta attiva per riduzione con ascorbato, retinolo o ubichinone.

Queste sostanze sono facilmente ossidabili, catturando i radicali liberi che si formano durante l'ossidazione all'aria dei composti insaturi, ed hanno le stesse funzioni sia nei cibi che nel tessuto cellulare.

I processi tecnici di lavorazione (specie la raffinazione) dell'olio riducono inevitabilmente la quantità di questa sostanza, con perdite nelle acque di vegetazione durante l'estrazione.

Per la determinazione, negli oli, dei tocoferoli naturali, nelle varie forme isomeriche e dell'alfa-tocoferili acetato è stato sviluppato un metodo che fa uso della cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC).

HPLC: High Performance Liquid Chromatography Cos‘è: è una tecnica estremamente versatile utilizzata per la determinazione qualitativa e/o quantitativa di uno o più analiti in matrici complesse, difficilmente risolvibili con altre tecniche analitiche; Su che si basa: sulla diversa affinità delle sostanze analizzate verso una fase mobile ed una fase stazionaria

Sotto l‘azione chimica e meccanica dell‘eluente si ha l‘eluizione delle molecole secondo un ordine preciso: la molecola che interagisce meno è eluita più velocemente, mentre tutte le altre si staccano secondo una sequenza legata alla crescente affinità.

S I S T E M A HPLC

Fasi mobili Le fasi mobili usate in HPLC sono liquide e servono per far eluire le varie sostanze nella fase stazionaria. La scelta di esse dipende dalla fase stazionaria utilizzata. I requisiti generali sono: bassa viscosità; Bassa volatilità; Minima tossicità possibile; Bassa corrosività; Elevata purezza

Fasi stazionarie La fase stazionaria è solitamente costituita da materiale solido con una granulometria dell‘ordine di 3/10mm. Esistono due tipi di fasi stazionarie: costituite da microparticelle porose di forma irregolare o sferiche con diverso grado di porosità; costituite da particelle pellicolari

Come è costituito uno strumento per HPLC Pompe: devono fornire elevate pressioni in ingresso e consentire rapide operazioni di ricambio della fase mobile e di pulizia; Filtri:impediscono che granelli di materiali entrino all'interno della colonna; Colonne:che possono essere di acciaio o in vetro la cui lunghezza può variare da 10 a 30cm.