Matteo Urbano Laboratorio di tecnologie abilitanti Modulo LTA Immunologiche Colture di cells in sospensione e in adesione Produzione di anticorpi monoclonali Reazione linfocitaria mista (MLR) Anno accademico 2014/2015 Matteo Urbano

Due linee di difesa

I. adattativa

I linfociti sono responsabili delle risposte immunitarie adattative

Lymphocyte Activation T cells and B cells are morphologically identical in the unstimulated or resting state. Upon stimulation by antigen, they become “activated” and begin to differentiate. Activated B cells become plasma cells. Activated T cells can become helper T cells or cytotoxic T cells.

T and B Cell Activation

Specific Immunity Teoria della selezione clonale Ogni organismo produce, soprattutto durante i primi anni di vita, un'enorme varietà di linfociti diversi in piccole quantità (cloni): solo quelli che vengono in contatto con antigeni specifici possono proliferare.

La cellula staminale si diversifica in numerosi linfociti B "vergini”, ognuno con un’immunoglobulina diversa sulla sua superficie. In seguito al contatto con un antigene solo il clone che presenta sulla superficie l'immunoglobulina per quell'antigene si replica e produce numerosi linfociti B contenenti solo l'immunoglobulina specifica per quell'antigene, che saranno rilasciate nel sangue per eliminare l'antigene, e cellule memoria che vivono a lungo (mesi/anni) e in caso di un nuovo attacco da parte di quell'antigene producono rapidamente gli anticorpi necessari per combatterlo.

la produzione di anticorpi monoclonali Le cellule B: la produzione di anticorpi monoclonali

B cells Clonal Selection B-lymphocyte binds antigen Stimulates reproduction of B-cells B-cell differentiates into memory cells and plasma cells Plasma cells produce soluble antibody Memory cells display antibody on surface

Immunoglobulin Structure Heavy & Light Chains Disulfide bonds Inter-chain Intra-chain CH1 VL CL VH CH2 CH3 Hinge Region Carbohydrate Disulfide bond

Immunoglobulin Fragments: Structure/Function Relationships Ag Binding Complement Binding Site Binding to Fc Receptors

Classes of Antibodies Five classes of antibodies (IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE) can be distinguished by differences in the heavy chain Differences in the heavy chains (the tail regions) impart distinctive functional properties to the classes of antibodies

Organizzazione strutturale dei principali isotipi delle Ig umane il termine isotipo fa riferimento alla classe o sottoclasse di un anticorpo, conferita dalla particolare configurazione della regione costante della catena pesante dell'immunoglobulina. Negli esseri umani sono note 5 tipi di catene differenti che insieme formano i 5 isotipi degli anticorpi: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Alcune di queste classi presentano anche delle sottoclassi. Differenze nel nr e nella localizzazione dei legami disolfuro che uniscono le catene. IgM e IgE non possiedeno la regione cerniera. Gli isotipi differiscono anche per la distribuzione delle catene glucidiche laterali legate agli aa della catena pesante, mostrate in verde

Antibody Production The antigen receptor (B-Cell Receptor, BCR) of a membrane bound antibody molecule is presented on the surface of a resting B cell. Upon activation, B cells proliferate and produce millions of copies of a secreted antibody with the same antigen binding sites.

La produzione degli anticorpi può avvenire nei confronti di: antigeni timo dipendenti, Ag TD, antigeni proteici, componenti virali, complessi aptene-carrier antigeni timo indipendenti, Ag TI, antigeni polivalenti con epitopi ripetuti (proprietà tipiche dei polisaccaridi batterici, polimeri proteici, lipopolisaccaridi, glicolipidi, acidi nucleici). Per gli Ag TD la produzione degli anticorpi richiede l’attivazione delle cells B da parte dei LT helper (CD4+, TH2). L’Ag viene ingerito da un fagocita (DC, MO) presentato alla cellula T helper che attiva la cell B causandone la trasformazione in plasmacellula.

Antigenic Determinants (Epitopes) The specific site of an antigen that binds to an antibody is called an antigenic determinant or epitope. Most antigens have a variety of epitopes that generate a number of different antibodies that are called polyclonal. A single idiotype of antibody to an antigen is termed monoclonal.

Polyclonal antiserum vs. monoclonal antibodies

Induzione deliberata di una risposta immunitaria Immunizzazione Induzione deliberata di una risposta immunitaria IMMUNOGENO: qualsiasi sostanza in grado di scatenare una risposta immunitaria ANTIGENE: qualsiasi sostanza che può legare uno specifico anticorpo (proteine, carboidrati, acidi nucleici, molecole organiche)

Induzione di una potente risposta infiammatoria Per ottenere una risposta immunitaria forte nei confronti di antigeni proteici è fondamentale che l’antigene sia iniettato insieme ad un adiuvante 1) Gli adiuvanti convertono gli antigeni proteici solubili in materiale particolato (più immunogenico) 2) Gli adiuvanti consentono un rilascio lento/prolungato dell’antigene 3) La maggior parte degli adiuvanti contiene componenti microbici che incrementano l’immunogenicità della preparazione, Induzione di una potente risposta infiammatoria

Adiuvante: qualsiasi sostanza che incrementa l’immunogenicità delle sostanze ad essa mescolate Freund’s: acqua con oli minerali (paraffina); Allume (sale di alluminio).

Immunizzazioni ripetute: Prima in CFA; successsive in IFA Aumento titolo anticorpi Aumento affinità (ipermutazione somatica) Switch di classe CFA: complete Freund’s adiuvant

Aptene-Carrier (proteina) Una risposta immunitaria anticorpale, che includa la generazione di memoria immunologica, può essere indotta da parte di antigeni non peptidici, solo quando questi vengono legati covalentemente a una proteina carrier Aptene-Carrier (proteina) Carrier: BSA (Bovine Serum Albumin) KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin) tossoide tetanico Aptene: Allergeni, polisaccaride batterico (Hemophilus influenzae B – TD) L'aptene è una molecola a basso peso molecolare che di per sé non induce una risposta anticorpale, ma se legata ad un carrier è in grado di stimolare la formazione di anticorpi specifici (zuccheri, peptidi, acidi nucleici, steroidi e farmaci legati a carriers proteici). stimola la produzione di anticorpi contro se stessa

Aptene: antigene incompleto, capace di indurre la formazione di anticorpi specifici solo se coniugato con una proteina. Gli apteni sono sostanze a basso peso molecolare, molto diffusi nell’ambiente esterno, che possono unirsi a proteine dell’organismo con cui vengono a contatto trasformandosi in antigeni completi verso i quali l’organismo produrrà anticorpi.Questo fenomeno è alla base di molte reazioni allergiche: asma, orticaria ecc. Utilizzazione. Il complesso aptene-carrier, inoculato in animale, determina la produzione di anticorpi diretti sia contro il complesso sia contro il carrier, ma soprattutto contro l’aptene stesso. Questo meccanismo è ampiamente sfruttato per produrre anticorpi capaci di consentire, una volta purificati, il loro uso in test immunometrici per il dosaggio di piccole molecole come farmaci, droghe e ormoni.

In 1975, Kohler and Milstein first fused lymphocytes to produce a cell line which was both immortal and a producer of specific antibodies. The two scientists were awarded the Nobel Prize for Medicine in 1984 for the development of this "hybridoma." The value of hybridomas to the field was not truly appreciated until about 1987, when MAbs were regularly produced in rodents for diagnostics.

Activated B cells have a limited lifetime when grown in culture. Monoclonal Antibodies Selection and Production Activated B cells contain a mixture of antibodies directed against different epitopes. Activated B cells have a limited lifetime when grown in culture. How can we select a single B cell clone (monoclonal) and propagate the cell line?

Hybridomas B lymphocytes can mutate into tumor cells that result in a type of cancer termed myeloma. Myeloma cells become “immortal” and will grow indefinitely in culture. Fusion of a single activated B cell and a myeloma cell will create a hybridoma that can grow indefinitely in culture.

Antibodies can be raised in mice by injection of an antigen. Monoclonal Antibodies The Mouse System Antibodies can be raised in mice by injection of an antigen. Repeated injections create a pool of activated B cells. Removal of the spleen and fusion with myeloma cells creates a pool of hybridomas. Dilution and culture creates many monoclonal cell lines.

Myeloma cells, mutant Caratteristiche: no Ab production HGPRT- TK- Ipoxantina Guanina FosfoRibosil Transferasi TK-

Selezione degli ibridomi E’ necessario creare condizioni di coltura in cui solo gli ibridomi siano capaci di sintetizzare il DNA Sistema HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina) La sintesi di DNA è condizionata alla presenza di NTP sintetizzati a partire dai rispettivi monofosfati Gli NTP si formano da: a- sintesi De novo (via normale) b - via di salvataggio (via alternativa)

HAT H = ipoxantina A= aminopterina T = timidina L’ipoxantina è usata come sorgente esogena di purine, è fosforilata dall’enzima Ipoxantina Guanina FosfoRibosil Transferasi (HGPRT) a formare IMP che, alternativamente, può essere convertito a AMP e GMP A= aminopterina L’aminopterina blocca tutte le reazione dell’enzima diidrofosfato reduttasi (DHPR) che è coinvolto nella sintesi de novo di AMP e GMP e anche nella metilazione di UMP a formare dTMP. Di conseguenza, la cellula diventa completamente dipendente dalla via di salvataggio per produrre i trifosfati purinici e pirimidinici per la sintesi del DNA T = timidina La timidina usata come sorgente esogena, è fosforilata dalla timidina chinasi (TK) per formare TMP.

Impiego degli anticorpi monoclonali

Immunofluorescience

Il rigetto dei trapianti Cellule T: Il rigetto dei trapianti

Tipi di trapianto Autologo, trapianto da un individuo allo stesso individuo (cambio solo di sede); Singenico, tra due individui geneticamente identici (gemelli identici – monozigoti); Allogenico, tra due individui della stessa specie ma geneticamente differenti MHCa

MHC restriction delle cellule T (Zinkernagel & Doherty 1974) Il ruolo principale delle molecole MHC è di iniziare una risposta immunitaria presentando peptidi antigenici sulla superficie delle cellule che possano essere riconosciuti dal TCR. Interazione MHC-TCR all’inizio di una risposta immunitaria avviene fra APC e T cells. 57

MOLECULES OF T LYMPHOCYTE RECOGNITION Glycoproteins expressed on the surface of cells. MHC class I is composed of one polypeptide, non-covalently associated with b2microglobulin. MHC class II is composed of two polypeptides, referred to as a and b. a b CD4 T-CELL TCR ab CD4 CD3 CD8 T-CELL CD8 a b TCR ab CD3 9 aa peptide 15 aa peptide CLASS I MHC b2m a2 a1 a3 ANTIGEN PRESENTING CELL ANTIGEN PRESENTING CELL MHC CLASS II a1 b1 b2 a2

MHC Class I: HLA-A, -B, -C. 1 catena pesante con 3 domni --> altissimo polimorfismo (1500 alleli) 2-microglobulina Class II: HLA-DR, -DP, -DQ. 1 catena  e 1 catena alto polimorfismo Espressione solo su APC

From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin

MHC-I MHC-II

From Janeway – Travers, Immuno Biologia, Piccin

Se è vero che il recettore dei linfociti T (TCR) riconosce un complesso formato da un peptide antigenico non-self e da una molecola MHC self...allora come fanno alcuni linfociti T a rispondere a MHC non self?

l linfociti T (attraverso il CD4 e CD8) riconoscono solo alcuni residui peptidici degli MHC, alcuni di questi residui sono simili in MHC diversi. In condizioni fisiologiche non è possibile l'incontro di un MHC non self, il problema si verifica soprattutto nei trapianti. L'organo trapiantato può infatti conservare alcune APC che presentano quindi ai linfociti T dell'organismo ricevente peptidi estranei su MHC non self che vengono quindi riconosciuti a causa della somiglianza d alcuni residui.

ALLOREATTIVITA’ 10% delle T cells di un individuo sono in grado di riconoscere molecole MHC di un donatore. TRAPIANTI SOLIDI: T cell del ricevente attaccano organo donato con MHC diverso. TRAPIANTI DI MIDOLLO: T cell del donatore riconoscono MHC del ricevente --> “tempesta” di citochine --> GVHD 71

principale causa del rigetto di trapianti solidi; L’ALLORICONOSCIMENTO delle T cell avviene ad alta frequnza: 1/10 vs. 1/106/7 per T antigene specifiche. Alloriconoscimento principale causa del rigetto di trapianti solidi; principale causa del GVHD (Graft Versus Host Desease) in trapianti di midollo. 72