Aspetti biotecnologici avanzati della diagnostica microbiologica e virologica Antibiotico-resistenza nei micobatteri Enrico Tortoli

I farmaci antitubercolari ISONIAZIDE: battericida; attiva sui batteri in rapida moltiplicazione; probabilmente inibisce la sintesi degli ac. micolici STREPTOMICINA: battericida; attiva solo sui batteri extracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteica ETAMBUTOLO: batteriostatico; attivo sui batteri in rapida moltiplicazione; probabilmente inibisce la sintesi della parete RIFAMPICINA: battericida; attiva sia sui batteri in rapida moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata; inibisce la sintesi proteica PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con l’isoniazide), a pH acido, sui batteri intracellulari; meccanismo di azione sconosciuto

Le resistenze del M. tuberculosis sono dovute esclusivamente a mutazioni cromosomiche mutazioni responsabili di resistenze si verificano spontaneamente con frequenza variabile, a seconda dei farmaci, fra 1/106 e 1/108 la resistenza è il risultato della selezione dei mutanti resistenti, a seguito di mono-terapie o per difetto di compliance l’uso di almeno due farmaci abbassa la probabilità di comparsa di resistenze a livelli inferiori al numero di bacilli normalmente presenti in una singola lesione (108-1010 UFC) una resistenza si definisce primaria quando è già presente nel ceppo responsabile dell’infezione una resistenza si definisce secondaria quando insorge durante la terapia

Mutazioni e resistenze sono state trovate una o più mutazioni associate alla resistenza nei confronti dei singoli farmaci antitubercolari per nessun farmaco esiste una mutazione associata al 100% delle resistenze in molti casi il meccanismo di resistenza rimane oscuro

M. tuberculosis multiresistente si parla di multiresistenza quando un ceppo di M. tuberculosis è resistente almeno ad isoniazide e rifampicina non esiste una mutazione responsabile della multiresistenza che è invece il risultato della somma di mutazioni singole

Isoniazide I è noto da tempo che, in molti ceppi isoniazide-resistenti, l’attività catalasica è ridotta o assente tale difetto nella produzione di catalasi è il risultato di delezione o di mutazioni nel gene katG (gene della catalasi-perossidasi) circa il 60% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano alterazioni nel gene katG è stato ipotizzato che l’attività battericida dell’isoniazide si manifesti soltanto in seguito all’attivazione del farmaco operata dell’enzima catalasi-perossidasi

Isoniazide II circa il 10% dei ceppi isoniazide-resistenti che presentano il gene katG mutato hanno mutazioni anche nel gene ahpC codificante per una alchil-idroperossido reduttasi circa il 20% dei ceppi isoniazide-resistenti (ma anche la maggioranza dei ceppi etionamide-resistenti) presentano mutazioni nel gene inhA che codifica per un enzima probabilmente coinvolto nella sintesi degli acidi micolici; il prodotto del gene inhA potrebbe essere il bersaglio dell’isoniazide altri ipotizzano che il bersaglio dell’isoniazide sia la proteina, codificata dal gene kasA, che regola l’allungamento degli acidi grassi; mutazioni di tale gene sono presenti nel 15% dei ceppi isoniazide-resistenti

Streptomicina alcuni ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rpsL che codifica per la proteina ribosomiale S12 altri ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rrs che codifica per il rRNA 16S le suddette mutazioni, che si ritrovano complessivamente nel 70% circa dei ceppi resistenti, impediscono il legame dell’antibiotico al 16S rRNA e bloccano quindi il meccanismo con cui la streptomicina inibisce la sintesi proteica nessuna mutazione risulta per il momento associata al rimanente 30% dei ceppi streptomicina-resistenti

Rifampicina oltre il 97% dei ceppi resistenti alla rifampicina presentano mutazioni missense nel gene rpoB codificante per la subunità  della RNA-polimerasi le alterazioni nella RNA-polimerasi, conseguenti alle mutazioni, non consentono il legame della rifampicina che non può quindi interferire nella trascrizione del rRNA

Etambutolo il 70% circa dei ceppi resistenti all’etambutolo presentano mutazioni nel gene embB, uno dei geni del locus emb che codifica per varie arabinosil-transferasi le arabinosil-transferasi, che consentono la polimerizzazione dell’arabinano nei polisaccaridi della parete, potrebbero costituire il bersaglio dell’etambutolo

Pirazinamide la pirazinamide viene trasformata, dalla pirazinamidasi, in acido pirazinoico che ne costituisce il principio attivo; la maggior parte dei ceppi resistenti alla pirazinamide mancano di pirazinamidasi oltre l’80% dei ceppi pirazinamide-resistenti presentano mutazioni nel gene pncA codificante per la pirazinamidasi

Metodi genotipici di ricerca delle resistenze ricerca delle mutazioni associate con le resistenze sequenziamento genico Single Strand Conformation Polymorphism Restriction Fragment Lenght Polymorphism ibridizzazione in fase solida formazione di eteroduplex tutte le tecniche richiedono la preventiva amplificazione delle sequenze in cui si ricercano le mutazioni

SSCP denaturazione termica della sequenza precedentemente amplificata i filamenti a catena singola si ripiegano spontaneamente assumendo una conformazione (e conseguentemente una mobilità elettroforetica) variabile in conseguenza della presenza di mutazioni separazione elettroforetica e identificazione delle mutazioni in base alla posizione delle bande la tecnica è stata messa a punto, anche in automazione, per la ricerca della resistenza alla rifampicina ma è utilizzabile anche per altri farmaci

INNO-LiPA Rif-TB amplificazione del gene rpoB del M. tuberculosis, codificante per la subunità  della RNA polimerasi ibridizzazione dell'eventuale amplificato con sonde, immobilizzate su una striscia di nitrocellulosa, specifiche per: il gene rpoB le 5 subunità, di tale gene, più frequentemente sedi delle mutazioni che determinano la comparsa di resistenze alla rifampicina 4 subunità presentanti mutazioni, causa di rifampicino-resistenza rilevamento dell'eventuale ibridizzazione mediante aggiunta di avidina-fosfatasi e substrato cromogeno (i primer utilizzati per l'amplificazione sono marcati con biotina) riconoscimento del M. tuberculosis dalla presenza della banda corrispondente al gene rpoB riconoscimento della resistenza alla rifampicina dalla mancanza di una delle bande corrispondenti alle subunità del gene non mutato e/o dalla presenza di una banda corrispondente ad una mutazione

RFLP la comparsa di una mutazione può determinare la perdita (o l’insorgenza) di un sito di restrizione sottoponendo la sequenza preventivamente amplificata, all’azione di uno specifico enzima di restrizione si ottengono pattern diversi a seconda che in essa siano o meno presenti mutazioni

RFLP

Formazione di eteroduplex amplificazione di una sequenza al cui interno si ricercano le mutazioni combinazione del prodotto di amplificazione con quello ottenuto da un ceppo sensibile denaturazione termica formazione spontanea di DNA a doppia elica separazione elettroforetica la presenza di più bande è indice di mutazione, infatti gli ibridi formati da filamenti provenienti da un ceppo sensibile ed uno resistente (eteroduplex), hanno mobilità elettroforetica diversa da quella delle doppie eliche omogenee (sensibile-sensibile e resistente-resistente)

Conclusioni i metodi genotipici sono rapidi, permettono infatti di eliminare i passaggi della coltura e del test di sensibilità la negatività di un test genotipico non permette di escludere la resistenza, sono infatti ancora numerose le resistenze fenotipiche per le quali non è nota l’associazione ad alcuna mutazione; la conferma con il test di sensibilità in vitro è quindi indispensabile la corrispondenza, ad una singola resistenza fenotipica, di più meccanismi genetici rende estremamente complessa l’esecuzione dei test genotipici l’esecuzione dei test genetici direttamente sul materiale clinico richiede solitamente una doppia amplificazione (PCR nested)