TERRENI DI COLTURA

Una condizione per poter studiare i microrganismi è poterli coltivare nelle condizioni di laboratorio Per questo scopo si devono conoscere quali sostanze nutritizie e quali condizioni fisiche essi richiedono

COLTIVAZIONE DEI BATTERI La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l’impiego di “terreni di coltura” con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare

I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo La composizione chimica dei diversi terreni di coltura è in parte differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera coltivare

servono per la sintesi dei componenti strutturali della cellula Alcune sostanze sono necessarie a tutti i microrganismi, in quantità notevoli: si tratta di quelle che sono necessarie per le biosintesi, e che entrano quindi a far parte delle principali componenti strutturali della cellula, come carboidrati, proteine, lipidi e acidi nucleici Queste sostanze vengono definite: “Macronutrienti” CARBONIO AZOTO OSSIGENO IDROGENO ZOLFO FOSFORO servono per la sintesi dei componenti strutturali della cellula

In un secondo gruppo di macronutrienti si trovano gli elementi usati in quantità relativamente elevate rispetto agli altri sali. La maggior parte di queste sostanze è necessaria a tutti i batteri, ma alcune sono fondamentali soltanto per alcune specie o in particolari momenti

Alcuni elementi sono necessari alla cellula, ma in quantità molto esigue: generalmente le tracce contenute in sali o nell’acqua sono sufficienti a garantire la crescita del microrganismo Se tuttavia si usano sali e acqua particolarmente puri, questi elementi devono essere aggiunti ai terreni sotto forma di soluzioni bilanciate Queste sostanze vengono definite: “Micronutrienti”

TRASPORTO DEI NUTRIENTI ALL’INTERNO DELLA CELLULA Per poter utilizzare i nutrienti è necessario portarli all’interno della cellula: l’unico composto chimico che entra o esce senza difficoltà alcuna dalla cellula batterica, è l’acqua TRASPORTO FACILITATO Alcuni soluti possono passare il filtro della membrana per diffusione passiva (senza spesa di energia da parte del microrganismo) questo processo è tuttavia poco efficiente e troppo lento e i procarioti fanno ricorso a enzimi di membrana (le permeasi) TRASPORTO ATTIVO la concentrazione interna si mantiene superiore a quella esterna, spendendo energia L’energia spesa per il trasporto dei nutrienti può provenire dall’ idrolisi di ATP

I terreni che si usano in batteriologia devono: contenere tutti i nutrienti necessari alla crescita dai batteri da coltivare l’acqua disponibile (Aw) deve essere adeguata (per la maggior parte dei microrganismi l’ideale è superiore a 0,98) il pH deve essere intorno a 7,2 a meno di richieste particolari, e il potenziale redox idoneo Possono essere liquidi (per ottenere biomassa senza limiti spaziali), o solidi

Per solidificare i terreni si impiega L’AGAR Un polisaccaride, estratto da alghe, che presenta il fenomeno della sovrafusione (liquefa a 100°C ma resta liquefatto fino a 45°C). L’uso dell’agar permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare Inoltre: non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri; non manifesta alcuna tossicità;

invisibili ad occhio nudo i microrganismi invisibili ad occhio nudo (<0,2 mm) si rendono visibili, dopo replicazione su substrato solido o liquido

Preparazione dei terreni Dissoluzione degli ingredienti in volume di H2O. Determinazione del pH ed eventuale correzione. Distribuzione in contenitori idonei. Sterilizzazione

Terreni sintetici o definiti In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni relative, i terreni di coltura sono classificati come: Sintetici (o definiti) Complessi Terreni sintetici o definiti I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si conosce l’esatta composizione. Vengono quasi sempre preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo che si desidera far crescere. Contengono un numero definito di sostanze a concentrazione nota.

Oltre alle sostanze “standard” i terreni complessi contengono: sono quei terreni di cui non si conosce in maniera dettagliata la composizione chimica Questi mezzi di coltura risultano di estrema utilità in quanto permettono di far crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro Inoltre è possibile crescere specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute Oltre alle sostanze “standard” i terreni complessi contengono: Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica (questi particolari proteine son parzialmente idrolizzate altrimenti denaturerebbero ad alte temperature); Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi peptidi, acidi organici, vitamine e sali minerali; Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell’azoto.

I caratteri colturali forniscono indizi utili per l’identificazione COLONIE SU AGAR ACCRESCIMENTO SU AGAR A BECCO DI CLARINO ACRESCIMENTO SU BRODO NUTRITIZIO ACCRESCIMENTO PER INFISSIONE IN GELATINA

Caratteristiche visive dell’avvenuto accrescimento in brodo

Crescita in terreni solidi (piastre Petri)

Crescita in substrati solidi (agar becco di clarino)

POPOLAZIONI MICROBICHE NATURALI La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è grande e complessa. Molte differenti specie microbiche popolano contemporaneamente vari distretti del nostro corpo (mucose: orale, intestinale, cutanea) ed in modo analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua). COLTURE MISTE

PER STUDIARE I DIVERSI BATTERI CHE COLONIZZANO UN HABITAT O PER ISOLARE UN PATOGENO BISOGNA ISOLARE E COLTIVARE IN FORMA PURA IL MICRORGANISMO Una coltura pura è costituita da una popolazione di cellule derivate tutte da un’unica cellula madre Essa rappresenta una condizione artificiale per l’accrescimento dei batteri ed è una condizione imposta da manipolazioni di laboratorio

Classificazione qualitativa dei terreni Terreni elettivi Sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o cavallo, che consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche di interesse medico. Terreni selettivi Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie. Terreni differenziali Sono terreni che, grazie alla presenza di particolari componenti, permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata. Terreni di arricchimento Sono terreni che consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in esame.

ESEMPIO DI TERRENO DIFFERENZIALE a - b - g - emolisi su piastra di agar sangue

Terreni selettivi e differenziali selettivi perché favoriscono la crescita di determinate specie batteriche inibendone altre differenziali perché permettono la crescita di colonie dello stesso genere ma di specie diverse

SELETTIVO E DIFFERENZIALE ESEMPIO DI TERRENO SELETTIVO E DIFFERENZIALE Fermentazione del mannitolo in piastra di MSA

ASETTICITA' Le finalità : ottenere e mantenere pure le colture di microrganismi Una “coltura pura” è costituita solo da una specie di microrganismo. La contaminazione delle colture è a rischio in quanto i microbi si trovano ovunque, sulla pelle, nell’aria. volgere il lavoro in un laboratorio di microbiologia in sicurezza

Le regole fondamentali di asetticità sono: la fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu e alta circa 5 cm quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla vedere facilmente sterilizzare la vetreria e il materiale usati disinfettare e pulire il banco da lavoro accuratamente sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto