Dipartimento di Scienze Agrarie ALLA RICERCA DELLA MELA CHE NON DA’ ALLERGIA Stefano Tartarini Dipartimento di Scienze Agrarie Alma Mater Studiorum - Università di Bologna 2° Congresso Regionale SIAIP Emilia Romagna “Quando il bambino è allergico: la pratica pediatrica orientata dalla medicina scientifica è il supporto alla famiglia e alla Scuola per ottimizzare la qualità di vita e l’ambiente in cui vive” Bologna, 27 febbraio 2015

La mela e l’allergenicita’ Mela: tra i frutti che più frequentemente causano reazioni allergiche (www.foodallergyitalia.org) Due modelli di diffusione allergia alla mela in Europa: Nord e Centro Europa più frequente (2% della popolazione) reattività crociata con polline di betulla (Bet v1) sindrome orale-allergica (OAS) Area Mediterranea meno frequente non associata a polline allergeni stabili alla proteolisi e resistenti a trattamenti termici sindrome gastro-intestinale

Gli allergeni della mela Mal d 1 Mal d 2 Mal d 3 Mal d 4 PROFILINE PROTEINE PR (PATHOGENESIS RELATED) PROTEINE VEGETALI CHE SI ACCUMULANO O SI ESPRIMONO IN RISPOSTA ALL’ATTACCO DI PATOGENI O IN CONDIZIONI DI STRESS PROTEINE CHE LEGANO L’ACTINA (Mills et al., 2003)

Biodiversita’ delle mele Mele diverse hanno un diverso potenziale allergenico

Studi sugli allergeni della mela Analisi dell’allergenicità di diversi genotipi di melo attraverso “Prick-to-prick skin-prick tests”

Prick-to-prick skin-prick tests (Bolhaar et al., 2006)

Prick-to-prick skin-prick tests (Vlieg-Boestra et al., 2011)

Single-blind Oral Food Challenge (SBFC) Sintomi soggettivi mediante “Visual Analogue Scale” (VAS) Van der Maas and Schenk, 2009 Development of a protocol that allows safe consumption of the hypoallergenic apple cv. Santana Acta Hort 841:240-252 (Vlieg-Boestra et al., 2011)

Prick-to-prick skin-prick tests Analisi dell’allergenicità di diversi frutti di melo Allergenicità polpa Allergenicità buccia (Ricci et al., 2010)

Studi sugli allergeni della mela Localizzazione tissutale: immuno-tissue printing Mal d 1 Mal d 2 Mal d 3 ctrl = negative control was incubated with conjugated second step antibody only. GD = Golden Delicious, GS = Granny Smith, IR = Idared, RD = Red Delicious. (Marzban et al., 2005)

ALLA RICERCA DELLA MELA CHE NON DA’ ALLERGIA Utilizzo di strumenti genetici, genomici, trascrittomici e proteomici per la caratterizzazione delle proteine allergeniche della mela

sono famiglie geniche complesse Identificazione sequenze allergeni Allergeni della mela Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3 e Mal d 4 sono famiglie geniche complesse (Velasco et al., 2010)

Approccio genomico Localizzazione Mal d 1 nel genoma del melo: - diversi cromosomi (1, 4, 6, 13 e 16) - organizzazione in cluster (Pagliarani et al., 2012)

Quali geni sono responsabili dell’allergenicità? Approccio genomico Famiglia genica Mal d 1 Almeno 31 isoforme di Mal d 1 Varianti alleliche in cv. diverse Quali geni sono responsabili dell’allergenicità?

Ipotesi: diverso coinvolgimento nell’allergia Approccio trascrittomico Studi espressione genica (Real Time PCR) in diversi genotipi e tessuti della mela Alta variabilità di espressione Ipotesi: diverso coinvolgimento nell’allergia (Pagliarani et al., 2013)

Approccio proteomico Clonaggio diversi geni Mal d 1 in vettori di espressione Mal d 1.02, 1.03, 1.06, 1.07, 1.13, Mal d 2.01, Mal d 3.01, 3.04, 3N, Mal d 4.03 Produzione di proteine ricombinanti Mal d 1 in E. coli Purificazione e separazione proteine Analisi immunologica con sieri di pazienti

Approccio proteomico Siero di paziente allergico Siero di paziente non allergico L’analisi delle proteine Mal d 1, 2, 3 e 4 con sieri di pazienti pediatrici allergici mostra un segnale maggiore rispetto ai controlli negativi

Approccio biotecnologico Silenziamento genico di specifiche proteine Mal d 1 Trasformazione genetica in vitro di piantine di melo (cv. Elstar) Piantine di melo trasformate geneticamente Diminuzione allergenicità delle piantine di melo geneticamente trasformate (Gilissen et al., 2005)

Conclusioni Variabilità genetica della specie MELO  identificazione di genotipi ipoallergenici Diversa localizzazione degli allergeni nella mela  diversa modalità di consumo in f (tipo di allergia) Es. Mal d 3 localizzato nella buccia  sbucciare frutto per allergia di tipo “mediterraneo” (da verificare) Messa a punto di strumenti per l’identificazione dei determinanti dell’allergenicità  genomici, trascrittomici e proteomici

Conclusioni Verificare l’influenza delle tecniche di coltivazione e conservazione dei frutti sull’allergenicità  Identificazioni delle migliori tecniche per diminuire il potenziale allergenico Produrre nuove varietà migliorate  dettagliate analisi nelle genebank di melo alla ricerca di mele NON allergeniche (per specifici allergeni )  costituzione di nuove varietà ipoallergeniche mediante miglioramento genetico tradizionale Sviluppare nuovi prodotti biotecnologici (futuro)  silenziamento mirato di specifici allergeni

Variabilità pianta – Variabilità pazienti Conclusioni Importanza di approcci interdisciplinari per ottenere mele ipo-allergeniche Scienze Agrarie Allergologia Biotecnologie Immunologia Variabilità pianta – Variabilità pazienti

Ringraziamenti DIMEC: Ricci G., Masi M., Belotti T., Dondi A., Giannetti A., Calamelli E. BiGeA: Del Duca S., Serafini Fracassini D., Iorio A.R. DipSA: Pagliarani G., Paris R., Savazzini F., Dondini L. Delledonne M., Venturini L. Botton A., Vegro M. Van de Weg E., Arens P.