Cinetica Chimica & Enzimatica

A B Velocità di reazione dt d[A] d[B] V = - = V= Velocità istantanea: coefficiente angolare della retta tangente alla curva in quel punto Quando t=0 la velocità istantanea sarà massima (V0) 2

Urti molecolari e velocità di reazione (1) Teoria delle collisioni (Arrhenius, 1888) A ─ A Es: A2 B-B + B2 B B A A → [A2B2] B B A A → 2AB Ogni reazione chimica decorre attraverso la formazione di un “Complesso attivato” generato da un “urto efficace” Complesso attivato 2AB A2B2 A2+ B2 A ─ A B B A A B A Coordinata di reazione Energia libera, G Condizioni per un “urto efficace”: Sufficiente energia (almeno pari a Ea) Giusto orientamento (Effetto sterico) Ea Energia di attivazione

Urti molecolari e velocità di reazione (2) Effetto Sterico Es1: OH- + CH3Cl  [OH … CH3Cl]-  CH3OH + Cl- Sono efficaci soltanto gli urti nei quali lo ione ossidrile attacca l’alogeno-derivato alchilico dal lato opposto a quello dove è legato l’atomo di alogeno - + Es2: N2O + NO  [N-N…O…N-O]#  N2 + NO2

Urti molecolari e velocità di reazione (3) Energia di attivazione L’energia di attivazione (Ea) corrisponde alla minima energia necessaria per un urto efficace Minore è il valore di Ea maggiore è il numero di molecole in grado di superare la barriera energetica e formare i prodotti La reazione anche se è termodinamicamente spontanea (DGr<0) potrebbe non avvenire se non attivata Spontaneità di reazione non vuol dire immediatezza

Urti molecolari e velocità di reazione (4) Energia di attivazione Es: 2H2 + O2 → 2 H20 DG° = - 115 Kcal/mol La reazione da un punto di vista termodinamico è spontanea ma non avviene. Occorre una scintilla che innesca la reazione la quale poi continuerà a fornire l’energia di attivazione necessaria perché altre molecole di H2 e O2 reagiscano H Energia libera, G H H Coordinata di reazione Ea O - O A A O - DGr<0 O O

NE=N • e-Ea /RT Teoria delle Collisioni e Temperatura T1 T2 T3 NE N Ea B NE=N • e-Ea /RT NE N Aumentando la temperatura, aumenta l’energia cinetica media (ECm) delle molecole e di conseguenza aumenta il n°di molecole (NE) aventi l’energia minima necessaria per formare il complesso attivato (Ea). Si può dimostrare (Arrhenius,1988) che a temperatura T, la frazione di molecole che hanno energia  Ea è proporzionale a e-E*/RT (area colorata sotto la curva) T1 < T2 < T3 T1 Ea T2 T3 ECm1 ECm2 ECm3 Energia cinetica

Parametri che influenzano la velocità di reazione Secondo quanto detto sulla teoria delle collisioni è evidente che la velocità di una reazione chimica dipende da: Temperatura (energia cinetica) Energia di attivazione (barriera energetica) Fattore Sterico A (orientamento dell’urto molecolare) k = A·e-Ea/RT Costante cinetica Concentrazione dei reagenti (numero degli urti) V = k · [Concentrazione]

Concentrazione e velocità di reazione V = k · [A]m · [B]n aA + bB  cC + dD m,n : Ordine di reazione di un singolo reagente (si ricava solo sperimentalmente) m + n : Ordine di reazione complessivo Molecolarità : n° di particelle (molecole, atomi, ioni) che urtano per dar luogo ad un singolo atto reattivo (reazione elementare) Es1: H2 + I2  2HI V=k[H2][ I2] 2° ordine, bimolecolare Es2: 2N2O5  4NO2 + O2 V=k[N2O5] 1° ordine Es3: 2NO+H2  N2 + 2H2O V=k[NO]2[H2] 3° ordine, trimolecolare Es4: NO2+2HClNO+H2O+Cl2 V=k[NO][HCl] 2°ordine Solo nei processi elementari (Es1, 3) il coefficiente stechiometrico (a,b) coincide con l’ordine di reazione (m,n) e con la molecolarità

Determinazione ordine di reazione (1) A + B  C [A] [B] velocità (moli/litro) (moli/litro) (moli/litro/minuto) 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,05 0,2 0,2 0,1 V = k·[A] Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione è di 1° ordine, in quanto la sua velocità si dimezza quando viene dimezzata la concentrazione di A mentre non si raddoppia quando viene raddoppiata la concentrazione di B

Determinazione ordine di reazione (2) A + B  C [A] [B] velocità (moli/litro) (moli/litro) (moli/litro/minuto) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,4 0,2 0,2 0,4 V = k·[B]2 Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione è di 2° ordine rispetto a B, in quanto la sua velocità è proporzionale alla seconda potenza della concentrazione di B e non varia al variare della concentrazione di A

Determinazione ordine di reazione (3) A + B  C [A] [B] velocità (moli/litro) (moli/litro) (moli/litro/minuto) 0,2 0,3 0,10 0,4 0,6 0,40 0,2 0,6 0,20 V = k·[A]·[B] Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione è di 2° ordine, in quanto la sua velocità si duplica sia quando viene raddoppiata la concentrazione di A che quando viene raddoppiata la concentrazione di B Si può anche dire che la reazione è di 1° ordine rispetto ad A e di 1° ordine rispetto a B

A + B C V = k [A]2 V = k [B]2 V = k [A][B] Determinazione ordine di reazione (4) In generale una reazione viene definita di 2° ordine se la sua velocità risulta sperimentalmente essere funzione lineare della concentrazione di un solo reagente elevata al quadrato o al prodotto delle concentrazioni di due reagenti. Quindi, la reazione è di secondo ordine se si verifica sperimentalmente uno dei casi seguenti: A + B C V = k [A]2 V = k [B]2 V = k [A][B]

Meccanismo di reazione Salvo rare eccezioni l’equazione chimica rappresenta la somma di un certo numero di reazioni intermedie (Reazioni Elementari) da essa non desumibili La velocità di reazione è data dallo stadio lento (tappa limitante) Es: 2 ICl + H2  2 HCl + I2 V= k [ICl][H2] La reazione è il risultato di due reazioni elementari ICl + H2  HCl + HI Stadio lento V= k [ICl][H2] ICl + HI  HCl + I2 Stadio veloce 2 ICl + H2  2 HCl + I2 V= k [ICl][H2] HI = “Intermedio di reazione”

A  B  C  D FG H I La tappa limitante nelle reazioni a più stadi Reagenti Intermedi Prodotti Stadio 1 Stadio 2 Rapido Stadio limitante la velocità Lento A  B  C  D FG H I k La velocità totale del processo è uguale a quella della reazione più lenta (V= k[D]) Questo è spesso sfruttato negli organismi viventi per regolare il metabolismo

L’azione del catalizzatore (1) X + Y → X-Y Reazione non catalizzata (Ea alta, V bassa) X + C → X-C Reazioni in presenza di catalizzatore (C) X-C + Y → X-Y + C (Ea bassa, V alta) X + Y → X-Y C non si consuma perché riciclato XY Il catalizzatore diminuisce Ea facendo percorrere alla reazione un cammino diverso senza variare il valore di DG Il catalizzatore non rende spontaneo un processo endoergonico Ea XC+Y Energia libera, G EaC X + Y DG X-Y coordinata di reazione

L’azione del catalizzatore (2) Es1: Esterificazione di un acido carbossilico La reazione è lenta ma viene accelerata aggiungendo un acido inorganico alla miscela di reazione H3C C OH + O H3C C OH + H+ H3C C OH C- OH H O- CH3 H3C- H3C -C + O C - HOH C O CH3 H3C H+ OH + H

L’azione del catalizzatore (3) Es2: 2H202 → 2H2O + O2 DG°= -50,2 Kcal/mol G H2O2+2Fe+2+2H+→2H2O+2Fe+3 H2O2 + 2Fe+3 →O2+2H++2Fe+2 2H2O2 2H2O + O2 Ea Eac H202 Fe+2 , H+ DGr 2H2O+O2 Fe+2 e H+ = catalizzatori coordinata di reazione Le bollicine di O2 che si sviluppano quando si versa H2O2 su una ferita sanguinante sono dovute all’azione catalitica della catalasi, un enzima presente nel sangue

Il catalizzatore e i reagenti sono nella stessa fase Catalisi omogenea Il catalizzatore e i reagenti sono nella stessa fase Video  Es: H2O2 + I- →H2O + IO- H2O2 + IO- →H2O + O2+ I- 2H2O2 → 2H2O +O2

Il catalizzatore e i reagenti NON sono nella stessa fase Catalisi eterogenea Il catalizzatore e i reagenti NON sono nella stessa fase Video  2H202 → 2H2O + O2 MnO2 Es1: Es2: Marmitta Catalitica CxHy + a O2  b CO2 + c H2O 2 CO + O2  2 CO2 2 NO  O2 + N2 2 NO2  2 O2 + N2 Al2O3

Equilibrio chimico e velocità di reazione (1) k1 R P t=0 k-1 P k1 t=eq R k-1

Equilibrio chimico e velocità di reazione (2) In generale per una reazione reversibile: aA + bB +   pP + qQ +  All’equilibrio avremo: Se l’equazione è scritta nella forma inversa: pP + qQ +   aA + bB +  da cui:

CATENA POLIPEPTIDICA ÷ COFATTORE Cinetica Enzimatica “In vivo” ogni reazione è catalizzata da un enzima specifico Enzimi: Proteina (PM12.000÷1.000.000) Alto potere catalitico in condizioni blande di T, P e pH Elevata specificità e assenza di sottoprodotti Possibilità di regolazione fine Composizione CATENA POLIPEPTIDICA ÷ COFATTORE Coenzima o Gruppo prostetico (se legato covalentemente) Apoenzima Oloenzima

Gli enzimi sono classificati in base alle reazioni che catalizzano

Azione catalitica dell’enzima (1) L’aumento della velocità di reazione può variare di parecchi ordini di grandezza Es: Anidrasi carbonica 107 Fosfofruttomutasi 1012 Ureasi 1014

Azione catalitica dell’enzima (2) Effetto prossimità: l’enzima facilita l’urto efficace mediante un “aiuto sterico”

Azione catalitica dell’enzima (3) Un esempio di “Effetto di prossimità” nelle razioni organiche

Stereospecificità del sito catalitico Azione catalitica dell’enzima (4) Stereospecificità del sito catalitico

Azione catalitica dell’enzima (5) Stiramento e/o distorsione del legame da rompere

Analisi equazione di Michaelis & Menten E + S ES  P + E k1 k-1 kcat

Grafico dei doppi reciproci (Lineweaver & Burk)

Significato di Km (1) Il valore di Km indica il Es1: confronto dei valori di Km tra due enzimi con i relativi substrati Il valore di Km indica il grado di affinità di un enzima per un certo substrato Anidrasi carbonica 107 Fosfofruttomutasi 1012 Ureasi 1014

La Km più bassa riflette Significato di Km (2) La Km più bassa riflette una maggiore affinità dell’enzima per S 1 La Km più alta riflette una minore affinità dell’enzima per S 2 Es2: Confronto dei valori di Km della Esochinasi con due substrati diversi D-Glucosio (S1) Km=0,05 D-Fruttosio (S2) Km=1,5 Minore è il valore di Km, maggiore è l’affinità dell’enzima per quel substrato

Significato di Km (3) E + S ES  P + E ES E + S Spiegazione alternativa E + S ES  P + E k1 k-1 kcat se kcat<<k-1 (ipotesi quasi sempre verificata) avremo: “Costante di Dissociazione” del Complesso ES ES E + S k1 k-1 [ES] Alta → Ks bassa → Alta Affinità

Conoscendo [ET] e Vmax si può calcolare Kcat Significato di Vmax V0 = kcat [ES] [ET] = [E] + [ES] V0 [S] Vmax3 Vmax2 Vmax1 [E3]>[E2]>[E1] Vmax = kcat [ET] Vmax è una misura della concentrazione enzimatica e si esprime in Unità Internazionali (U) 1U= Quantità di enzima che catalizza la formazione di 1mM di prodotto per min in condizioni definite (pH, T, ...) Conoscendo [ET] e Vmax si può calcolare Kcat “Costante catalitica” o “Numero di turnover” (mM di substrato trasformate per min)

Effetto del pH sulla stabilità e attività dell’enzima  P         E ES E S  H+        E ES  OH- S         E ES

Effetto della Temperatura sulla stabilità e attività dell’enzima T ottimale  Risultato di due processi concorrenti: Aumento di V0 all’aumentare di T k = A·e-Ea/RT (vedi teoria degli urti di Arrenius) Diminuzione di V0 a temperature superiori a quella ottimale per la rottura di legami deboli della struttura terziaria della catena polipeptidica della proteina (vedi denaturazione delle proteine)

Inibizione enzimatica L’inibizione (Reversibile o Irreversibile) è uno dei maggiori sistemi di regolazione del metabolismo Inibizione Irreversibile k1 kcat E + S ES  P + E + I  EI “Complesso abortivo irreversibile” k-1 Km = Vmax  Es: Inibizione dell’ Acetilcolinesterasi con il gas nervino Diisopropilfluorofosfato (DIFP) (“Inibitore suicida” vedi anche 5F-U) E O CH3 CH2-OH + F-P-O-CH  H3C-CH-CH3 O CH3 CH2-OH-O-P-O-CH + HF .. Acetilcolinesterasi (degrada l’acetilcolina)

Inibizione Competitiva (IC) Km app Vmax = Kmapp 

Inibizione Competitiva (2) Es1: Antimetaboliti (sulfamidici, pro-farmaci analoghi di basi e nucleosidi purinici e pirimidinici) NH2 COOH Parte essenziale per l’attività Acido p-aminobenzoico Timidilato Sintetasi dUMP dTMP Diidrofolato Sintetasi (Solo batterica) Acido Folico DNA NH2 O=S=O H–N–R R=H: Sulfanilamide Negli animali non esiste la diidrofolato reduttasi. L’acido folico deve essere assunto dalla dieta (vitamina) “Antagonizza” l’incorporazione dell’acido p-aminobenzoico nell’acido folico

Inibizione Competitiva (3) Es2: Analogo non metabolizzabile COO- CH2 COO- CH HC Fumarato E-FAD E-FADH2 Succinato ) )+ + Sito attivo Succinico deidrogenasi COO- CH2 Malonato

Inibizione Competitiva (4) Es3: Analogo metabolizzabile C-C-O-H H H C-C=O Etanolo Alcool deidrogenasi NAD NADH + H+ Acetaldeide Idrossimetila proteine e acidi nucleici C-O-H H C=O H 30 ml di metanolo sono letali Metanolo Formaldeide

Inibizione Non Competitiva (INC) Vmax  Km =

Inibizione Incompetitiva (IIC) Vmax  Kmapp 

Schema riassuntivo dei grafici dei doppi reciproci IC, INC, IIC Vmax  Kmapp 

Enzimi oligomerici Macromolecole proteiche a più subunità (monomeri o protomeri) Se i siti catalitici sono indipendenti (non cooperativi) avremo enzimi con “cinetica classica Micheliana” (V0/[S] curva iperbolica) Se i siti sono dipendenti (cooperativi) avremo “enzimi allosterici” (V0/[S] curva sigmoide) Km K0.5

Enzimi allosterici L’interazione (binding) di una molecola di “legando” (substrato, inibitore, attivatore) con un sito catalitico di una subunità, modifica il binding, aumentando o diminuendo l’affinità degli altri siti liberi Interazioni omotropiche:stesso legando (substrato) Interazioni eterotropiche:legandi diversi (substrato,inibitore,attivatore)

Regolazione degli enzimi allosterici (1) Interazioni Omotropiche C V0 - + S S ½ Vmax S C [S] K0.5 S C

 -  +   ● Modulatore positivo(Attivatore) Regolazione degli enzimi allosterici (2) Interazioni Eterotropiche ► Substrato ● Modulatore positivo(Attivatore) ■ Modulatore negativo (Inibitore) C R S S -  +  S R C  

Due possibili modulazioni allosteriche Vmax  K0.5 = Vmax = K0.5 

Gli enzimi allosterici si trovano spesso Enzimi allosterici: chiave di controllo nella regolazione metabolica Gli enzimi allosterici si trovano spesso in punti strategici delle vie metaboliche ed agiscono con “effetto switch on-off”