“Tecniche laser per la diagnosi delle malattie genetiche” ALESSANDRA ANDREONI Universita’ degli Studi dell’Insubria Dipartimento di Fisica e Matematica Via Valleggio, 11 – 22100 Como (Italy) Andreoni@uninsubria.it Luca Nardo PhD Maria Bondani C.N.R. ROBERTO ACCOLLA Giovanna Tosi R.U. COMO LASER & POST-GENOMICA VARESE

PROGETTO GENOMA UMANO POST-GENOMICA Sequenziamento POST-GENOMICA Significato e funzioni delle sequenze di basi Trattare in modo più specifico patologie fino a oggi aggredite sulla base di bersagli molecolari già noti ma non sufficientemente selettivi Affrontare patologie che attualmente hanno scarsi presidi terapeutici Diagnosticare preventivamente l’insorgenza di malattie genetiche. □

UNINSUBRIA UNIMI POLIMI UNINA LASER IN BIO-MEDICINA 1973 1991 1987 Como Milan UNINSUBRIA 1987 UNINA 1991 1973 LASER IN BIO-MEDICINA MICRO- -FLUOROMETRIA SUB-CELLULARE LOCALIZZAZIONE INTRACELLULARE DI FARMACI FLUORESCENTI FOTO- -ATTIVAZIONE ANTITUMORALI ANTRACICLINE: FOTO- -ATTIVAZIONE E SITI DI LEGAME INTERAZIONE FARMACI-DNA: MECCANISMI DI LEGAME Naples

FLUORESCENZA ECCITATA DA LASER MICRO- -FLUOROMETRIA SUB-CELLULARE LOCALIZZAZIONE INTRACELLULARE DI FARMACI FLUORESCENTI FOCALIZZAZIONE DELL’ECCITAZIONE MICRO-IMMAGINI AD ALTISSIMA RISOLUZIONE SPAZIALE SELEZIONE DEL COLORANTE O FARMACO DA ECCITARE NEL MICRO-SPOT SCELTA lexc GRANDI POTENZIALITA’ IMPULSI ULTRA-BREVI

TEMPO DI VITA t DELLA MOLECOLA IN STATO ECCITATO E’ DETERMINATO DALLA PROBABILITA’ DI DECADERE EMETTENDO UN FOTONE DI FLUORESCENZA RISPETTO A QUELLA DI DECADERE LIBERANDOSI DELL’ENERGIA DI ECCITAZIONE PER ALTRA VIA NON-RADIATIVA FOTONE DI FLUORESCENZA ALTRA VIA NON-RADIATIVA

QUANTO PIU’ NUMEROSE (ED EFFICIENTI) SONO LE ALTRE VIE DI DECADIMENTO NON-RADIATIVE TANTO PIU’ BREVE E’ IL TEMPO DI VITA IN STATO ECCITATO E QUANTO PIU’ CORTO E’ L’IMPULSO FORMATO DAI FOTONI DI FLUORESCENZA I DECADIMENTI NON-RADIATIVI AVVENGONO PER INTERAZIONI DELLA MOLECOLA DI COLORANTE/FARMACO CON L’ENVIRONMENT ECCITAZIONE CON IMPULSI ULTRA-BREVI GRANDI POTENZIALITA’ MISURA RISOLTA IN TEMPO DELL’IMPULSO FORMATO DAI FOTONI DI FLUORESCENZA CARATTERIZZAZIONE DELLE INTERAZIONI DEL COLORANTE/FARMACO CON L’ENVIRONMENT

IMPULSO DI FLUORESCENZA: FÖRSTER RESONANT ENERGY TRANSFER (FRET) UN PARTICOLARE MECCANISMO DI DECADIMENTO NON-RADIATIVO IL FLUOROFORO ECCITATO DAL LASER VIENE FATTO INTERAGIRE CON UN’ALTRA MOLECOLA SPECIFICA D A Fluoroforo (DONOR) eccitato dal laser Acceptor (A) del FRET Struttura rigida tra D ed A D FRET: A DISECCITA NON-RADIATIVAMENTE QUANTO PIU’ GLI E’ VICINO DISTANZA D/A: IMPULSO DI FLUORESCENZA: Grande Lento Piccola Veloce

INTERAZIONE FARMACI-DNA: MECCANISMI DI LEGAME Minor groove binders Intercalators Entrambi impediscono la replica del tratto di DNA, ma gli intercalanti provocano errori nella replica delle sequenze adiacenti (mutazioni).

DNA-ligand binding modes Minor groove binders Intercalators ↔ PORTANO IL DNA AD ASSUMERE DIVERSE CONFIGURAZIONI? Frammenti di DNA a doppia elica: singole eliche della sequenza desiderata sonde di DNA con le sequenze complementari (A e T, C e G) D ed A per FRET attaccati agli estremi della sonda A T D C G D A Si aggiunge un Intercalator od un Minor groove binder Si cerca un effetto sulla distanza D-A studiando l’andamento temporale dell’impulso di fluorescenza emesso da D (TAMRA). DNA-ligand binding modes TAMRA BHQ2 BI MGB

DNA-Base Intercalator RISULTATI PER DOSI CRESCENTI DI: Minor groove binder DNA-Base Intercalator Durata dell’impulsodi fluorescenza Quantita’ relativa di MGB (HOEC) Quantita’ relativa di BI (QUIN) Minor groove binder avvicina A a D DNA BENDING: la doppia elica si piega Intercalator allontana A da D DNA STRETCHING: le doppie basi si allontanano l’una dall’altra TAMRA BHQ2 BI MGB 10

LASER & POST-GENOMICA Sequenziamento Polimorfismo dei Geni ROBERTO ACCOLLA Giovanna Tosi LASER & POST-GENOMICA VARESE Sequenziamento Significato e funzioni delle sequenze di basi Diagnosticare preventivamente l’insorgenza di malattie genetiche. Polimorfismo dei Geni Piccole differenze, da un individuo all’altro della stessa specie, nella sequenza di basi del DNA possono codificare per un carattere del fenotipo (v. biodiversita’, gruppo sanguigno, ecc.), ma anche essere associate allo sviluppo di malattie attraverso un’interferenza con processi biologici cellulari.

DISTANZE D-A? DIVERSI t? VARIANTE ALLELICA 0) A T D ALLELICA 1) Sequenza 0 → A T D ALLELICA 1) Sequenza 1 → Etc. Sonda della Sequenza 0 A T D Sequenza 0 A T Sequenza 1 T A Sequenza 2 A T Sequenza 3 A T DISTANZE D-A? DIVERSI t? PUNTI DI MISMATCHING Sonda/Sequenze 1 prima base 2 terzultima base 3 base al centro

S0 S1 S2 S3 R0 R1<R0 R2>R0 R3<R0 2662±8 ps 2621±18 ps D A S2 S1 S3 R1<R0 R3<R0 R2>R0 2662±8 ps 2621±18 ps 2765±3 ps 2300±20 ps 13

Single-Nucleotide Polymorphism Polimorfismi di Singole Basi Chromosome 6 Major histocompatibility complex (MHC) locus di massima variabilita’ allelica: class II Human Leukocyte Antigen (HLA) varianti alleliche responsabili per un gran numero di patologie 14

Rigetto degli organi trapiantati Celiachia Diabete Mellito Cromosoma 6 15

IDDM: Insulin-Dependent Diabetes Mellitus Variante allelica 0201 TAMRA BHQ2 e IDDM 16

IDDM: Misure di t D A t (ps) e 17

Sequenza del portatore di IDDM e t Massimo (perfetto matching sequenza/sonda) Sonda Specifica per la Sequenza 0201 Sequenza 0201 A C G T - ‑ D CONCLUSIONE L’unica sequenza che produce perfetto matching con la sonda per essa specifica tiene all’estrema distanza da . D A WORK IN PROGRESS La stessa sonda produce MASSIMO t aggiungendola al DNA (tutto) semplicemente estratto dai globuli bianchi del portatore di IDDM. e Tecnica per screening di massa di IDDM

Bibliografia A. Andreoni, M. Bondani, L. Nardo, “Feasibility of single nucleotide polymorphism genotyping with a single-probe by time-resolved Förster energy transfer” Molecular and Cellular Probes 23 (2009) 119-121. Available on line, doi:10.1016/j.mcp.2008.12.008 “A time-resolved FRET method for typing polymorphic alleles of the human leukocyte antigen system by using a single DNA probe” Photochem. Photobiol. Sci., 8 (2009) 1202-1206. Available on line, DOI:10.1039/ B906043J Highlighted in the magazines Chemical Technology (http://www.rsc.org/Publishing/ChemTech/index.asp) and Chemistry World (www.rsc.org/ChemistryWorld).   L. Nardo, M. Bondani, G. Tosi, R. S. Accolla, A. Andreoni “Molecular typing of single-nucleotide polymorphic genes by time-resolved fluorescence resonance energy transfer” in: Photobiology: Principles, Applications and Effects, ed. by Léon N. Collignon and Claud B. Normand  (Nova Science Publishers Inc., Hauppauge, NY, 2010). In press. Invited chapter. ISBN: 978-1-61668-005-3 

FLUORESCENCE DECAY of MOLECULES Light collected at 90 deg Nd:VAN, SH or TH Ti:sapphire, SH L SAMPLE BS LASER PULSES PIN ND ND CUTOFF ADJ. DIST. OBJ FIBER CFD TAC SPAD + AQC STOP START MCA CHANNEL Dt=1/(113 MHz) or Dt=1/(48 MHz)