Tecniche analitiche per l'autenticazione e la tracciabilità degli alimenti

Analiti utili per tracciabilità e autenticazione elementi e isotopi: si tratta di parametri spesso legati al terreno, in particolare per quanto riguarda gli elementi in tracce, e quindi idonei per la tracciabilità; sono utili anche per l'autenticazione elementi e isotopi: si tratta di parametri spesso legati al terreno, in particolare per quanto riguarda gli elementi in tracce, e quindi idonei per la tracciabilità; sono utili anche per l'autenticazione composti: una vastissima gamma di composti può essere sfruttata analiticamente per classificare e quindi autenticare gli alimenti; più difficile è impiegarli per la tracciabilità composti: una vastissima gamma di composti può essere sfruttata analiticamente per classificare e quindi autenticare gli alimenti; più difficile è impiegarli per la tracciabilità parametri spettrali: è possibile impiegare alcuni parametri spettrali, es. assorbanze a determinate, come variabili per ottenere classificazioni di gruppi di alimenti; anche in questo caso i parametri sono più idonei all'autenticazione che alla tracciabilità parametri spettrali: è possibile impiegare alcuni parametri spettrali, es. assorbanze a determinate, come variabili per ottenere classificazioni di gruppi di alimenti; anche in questo caso i parametri sono più idonei all'autenticazione che alla tracciabilità Molti parametri chimico-fisici sono utilizzabili allo scopo di autenticare o tracciare un prodotto alimentare. Essi sono di tre tipi:

Stable Isotope Analysis (SIA): probabilmente la tecnica più efficiente, sfrutta la spettrometria di massa o la tecnica NMR per evidenziare le distribuzioni isotopiche caratteristiche di materiali aventi origine diversa Stable Isotope Analysis (SIA): probabilmente la tecnica più efficiente, sfrutta la spettrometria di massa o la tecnica NMR per evidenziare le distribuzioni isotopiche caratteristiche di materiali aventi origine diversa Tecniche di analisi elementare (GF-AAS, ICP-AES, ICP-MS): si tratta di tecniche in grado di determinare quasi tutti gli elementi del sistema periodico a concentrazioni estremamente basse. Particolarmente promettente per la tracciabilità sembra essere la determinazione delle terre rare o lantanidi (REE) Tecniche di analisi elementare (GF-AAS, ICP-AES, ICP-MS): si tratta di tecniche in grado di determinare quasi tutti gli elementi del sistema periodico a concentrazioni estremamente basse. Particolarmente promettente per la tracciabilità sembra essere la determinazione delle terre rare o lantanidi (REE) Tecniche cromatografiche: un insieme di tecniche di separazione, alcune delle quali sono impiegate per la determinazione di classi di composti che possono essere utilizzati nella differenziazione di prodotti alimentari Tecniche cromatografiche: un insieme di tecniche di separazione, alcune delle quali sono impiegate per la determinazione di classi di composti che possono essere utilizzati nella differenziazione di prodotti alimentari Tecniche elettroforetiche: altro insieme di tecniche di separazione, di grande potenzialità nel campo agroalimentare Tecniche elettroforetiche: altro insieme di tecniche di separazione, di grande potenzialità nel campo agroalimentare Tecniche di analisi molecolare: molto diffuse in campo analitico, promettente la versione NIR (Near Infrared) Tecniche di analisi molecolare: molto diffuse in campo analitico, promettente la versione NIR (Near Infrared) Risonanza Magnetica Nucleare (NMR): si tratta di una tecnica potentissima per la differenziazione di prodotti alimentari di origine diversa o ottenute con procedimenti diversi vedi lezioni Prof. Botta Risonanza Magnetica Nucleare (NMR): si tratta di una tecnica potentissima per la differenziazione di prodotti alimentari di origine diversa o ottenute con procedimenti diversi vedi lezioni Prof. Botta Le tecniche potenzialmente più utili nel campo dell'autenticazione e della tracciabilità degli alimenti sono le seguenti:

Tecniche di analisi elementare Le tecniche di analisi elementare, e in particolare quelle di spettroscopia atomica, sono in grado di determinare elementi a livello di tracce e ultratracce. Spesso questi elementi fungono da marcatori, fornendo informazioni sull'origine delle materie prime con cui è confezionato un prodotto alimentare. Le tecniche di maggior utilità per l'autenticazione in campo agroalimentare sono le seguenti: spettroscopia di assorbimento atomico con fornetto di grafite (GF-AAS)spettroscopia di assorbimento atomico con fornetto di grafite (GF-AAS) spettroscopia di assorbimento atomico con fiamma (FAAS)spettroscopia di assorbimento atomico con fiamma (FAAS) tecniche al plasmatecniche al plasma spettroscopia di emissione atomica con plasma (ICP-AES)spettroscopia di emissione atomica con plasma (ICP-AES) spettrometria di massa con plasma (ICP-MS)spettrometria di massa con plasma (ICP-MS)

Spettroscopia di assorbimento atomico Metodo di atomizzazione Temperatura di atomizzazione (°C) TecnicaFiamma FAAS Elettrotermico GF-AAS, ET-AAS

Tecniche al plasma Plasma Monocromatore Detector Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry (ICP-AES) Plasma Analizzatore a quadrupolo Detector Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS)

Schema della strumentazione Sistema di introduzione del campioneSistema di introduzione del campione Torcia ICP e riserva di gasTorcia ICP e riserva di gas Generatore di radiofrequenzeGeneratore di radiofrequenze Spettrometro (ottico o massa)Spettrometro (ottico o massa) Rivelatori e sistema elettronico associatoRivelatori e sistema elettronico associato Sistema di controllo e acquisizione dati via PCSistema di controllo e acquisizione dati via PC Un tipico spettrometro al plasma è composto dalle seguenti parti:

Principio dellemissione atomica

Esempio di strumento ICP-AES Pompa peristaltica Nebulizzatore Camera di nebulizzazione Smaltimento fumi Sistema ottico 2 canali: 1 per il campione 1 per lo scarico al PC Torcia di quarzo in posizione assiale

Principio della separazione di ioni Sorgente ionica (plasma) Magnete m/z 56 (Fe + ) m/z 63 (Cu + ) m/z 64 (Zn + )

Lo strumento Pompa peristaltica Nebulizzatore Camera di nebulizzazione Smaltimento fumi Spettrometro di massa al PC Torcia di quarzo Interfaccia

Spettro di massa con ICP Ad ogni picco nellintervallo u.m.a. (unità di massa atomica) corrisponde uno ione monoelementare a massa/carica ben definita, oppure ioni poliatomici che costituiscono interferenze positive

Limiti di rivelabilità I limiti di rivelabilità più bassi si ottengono con la tecnica ICP-MS

Tecniche cromatografiche Tra le tecniche più idonee allanalisi di campioni agroalimentari vi sono le cosiddette tecniche cromatografiche, utilizzate per separare e identificare singolarmente i componenti di una miscela Il termine deriva dal greco ed è legato al suo inventore, un botanico russo di nome Tzwett (nato ad Asti), che allinizio del XX secolo intendeva separare le sostanze coloranti della clorofilla

La prima separazione Tswett intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; riempì una colonna di vetro con carbonato di calcio, vi depositò in testa un estratto di foglie verdi ed eluì con solfuro di carbonio: i vari pigmenti si separarono in bande colorate Tswett chiamò questa procedura cromatografia dal greco scrittura del colore o, visto il significato del suo cognome in russo, scrittura di Tswett

Queste tecniche sono molto varie, ma si basano tutte su un principio comune: esse sfruttano la differenza di interazione dei componenti di una miscela nei confronti di un supporto statico, la fase fissa o stazionaria, e di un supporto dinamico, la fase mobile o eluente, che fluisce attraverso la fase fissa trascinando le sostanze componenti la miscela. Durante lattraversamento, detto processo di eluizione, i componenti subiscono un rallentamento più o meno marcato a seconda della loro affinità per la fase fissa ed escono da essa a tempi diversi, in modo da poter essere identificati uno per uno. Le sostanze che compongono la miscela vengono identificate mediante un rivelatore posto alluscita dalla fase fissa che registra le modifiche di alcune proprietà chimico-fisiche. Il responso che si ottiene si chiama cromatogramma Principi della cromatografia

Tipi di cromatografia I due gruppi principali di tecniche cromatografiche sono: la cromatografia liquida, nella quale la fase mobile è liquida e la fase fissa è solida o liquida la cromatografia liquida, nella quale la fase mobile è liquida e la fase fissa è solida o liquida la gascromatografia, nella quale la fase mobile è gassosa e la fase fissa è solida o liquida la gascromatografia, nella quale la fase mobile è gassosa e la fase fissa è solida o liquida

Nella cromatografia liquida (LC) la fase fissa è una colonna o un supporto planare contenente il materiale attivo, la fase mobile è un liquido; essa è utilizzata per la separazione di sostanze poco volatili come idrocarburi ad alto peso molecolare, molecole biologiche (proteine, grassi), sostanze ioniche o ionizzabili (anioni, amine, zuccheri) Cromatografia liquida Particolarmente usate sono la cromatografia ad alta pressione o HPLC per la separazione di sostanze neutre e la cromatografia ionica (IC) per la separazione di sostanze ioniche

Esempio di cromatogramma Un esempio di analisi HPLC si ha nella figura sottostante, nella quale è mostrata la separazione e identificazione di antocianine in un campione di vino Cabernet Sauvignon

Recentemente, uno sviluppo importante della tecnica HPLC è stato linterfacciamento alla spettrometria di massa per ottenere strumenti LC-MS, in modo da poter avere in ogni istante lo spettro di massa delle sostanze separate Tecnica LC-MS La tecnica LC-MS consente di avere informazioni strutturali sulle molecole separate e quindi permette di riconoscere in maniera più semplice i vari composti. Quasi sempre gli alimenti, in quanto campioni di natura organica, sono miscele complesse contenenti numerose sostanze diverse

Un esempio di analisi HPLC-MS si ha nella figura sottostante, nella quale è mostrata la separazione di antocianine nel vino (sx alto) e gli spettri di massa relativi ad alcuni picchi

Nella gascromatografia (GC) la fase fissa è una colonna contenente il materiale attivo e la fase mobile è un gas; essa è utilizzata per la separazione di sostanze volatili o volatilizzabili come idrocarburi a basso peso molecolare, aromi, acidi organici. Tra le varie versioni, particolarmente utilizzata in campo agroalimentare è la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) che consente di avere informazioni strutturali sulle sostanze separate Gascromatografia

Esempio di gascromatografo Forno per la colonna Iniettore Impostazione dei parametri strumentali Interfaccia cromatografo – spettrometro di massa Spettrometro di massa al PC

Esempio di cromatogramma GC-MS cromatogramma tempo di ritenzione spettri di massa m/z I database di cui dispongono i moderni strumenti GC-MS contengono gli spettri di massa di circa composti, tra cui quasi tutti quelli di interesse in chimica degli alimenti. Per confronto, è sempre possibile riconoscere i composti separati m/z

Un esempio di analisi GC-MS si ha nella figura sottostante, nella quale è mostrata la separazione e identificazione di composti volatili in un vino Nebbiolo mediante SPME

Tecniche elettroforetiche Le tecniche elettroforetiche sono spesso associate alle tecniche cromatografiche, in quanto permettono la separazione di miscele di ioni che migrano sotto leffetto di un campo elettrico con diverse velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria. Per questo sono chiamate anche tecniche ancillari rispetto alle cromatografiche. La strumentazione richiesta è comunque affine e quindi sono valide molte delle nozioni acquisite in campo cromatografico. La rivelazione delle sostanze avviene per via fotometrica, con detector elettrochimico o mediante interfacciamento con uno spettrometro di massa Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate in campo biologico, biochimico e molecolare per la separazione di proteine, polinucleotidi e altri biopolimeri, e in generale di ioni e anfoliti (sostanze che si comportano come acidi o basi a seconda del pH, es. aminoacidi e peptidi)

Applicazioni della CE Dal momento che la stragrande maggioranza delle molecole di interesse biologico, e quindi agroalimentare, è carica, la CE ha applicazioni importanti nellanalisi di aminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici a altri biopolimeri, con tempi di analisi minori rispetto a tecniche cromatografiche equivalenti (es. SEC). In particolare, per lanalisi di proteine e peptidi è possibile separare analiti che differiscono per un solo aminoacido Nella figura è mostrata lanalisi di una miscela di sostanze varie impiegate come additivi negli alimenti

Tecniche spettroscopiche I metodi di riconoscimento delle adulterazioni e gli studi di classificazione descritti sinora sono basati sulla determinazione quali- e quantitativa di analiti, siano essi elementi, composti o isotopi Un approccio differente consiste nella determinazione di parametri spettroscopici quali lassorbanza o la riflessione dei campioni a determinate lunghezze donda, fenomeni che sono causati dalla presenza nel campione di molecole che sono in grado di assorbire o di riflettere la luce. Questi fenomeni possono essere utilizzati come variabili, senza riferimento specifico alle molecole che li causano, a scopo di classificazione La determinazione quali- e quantitativa di questi parametri si effettua con tecniche spettroscopiche di analisi molecolare, che si differenziano per lintervallo spettrale utilizzato: sono attualmente impiegate lUV- visibile e lInfrarosso

Spettroscopie molecolari Il campione è irraggiato con luce avente nellUV, nel visibile o nellinfrarossoIl campione è irraggiato con luce avente nellUV, nel visibile o nellinfrarosso Le molecole che compongono il campione assorbono lenergia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV- visibile)Le molecole che compongono il campione assorbono lenergia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV- visibile) La risposta del campione viene registrata sotto forma di spettro e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole, oppure è possibile sfruttare gli assorbimenti alle singole a scopo di classificazioneLa risposta del campione viene registrata sotto forma di spettro e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole, oppure è possibile sfruttare gli assorbimenti alle singole a scopo di classificazione Le tecniche di analisi molecolare sono utilizzate per determinare composti. Esse sono basate genericamente sui seguenti passaggi:

Spettroscopia Infrarossa Questa tecnica si basa sullinterazione tra la materia e le radiazioni infrarosse, cioè radiazioni ad energia inferiore a quella della radiazione visibile (al di sopra di 800 nm) L'intervallo spettrale utilizzato comprende radiazioni la cui energia è sufficiente per far vibrare in maniera specifica i gruppi funzionali delle molecole, cioè pezzi di molecole aventi caratteristiche particolari tali da impartire ai composti che li contengono proprietà chimico-fisiche rilevanti; attraverso lassorbimento di radiazione IR è possibile lidentificazione dei gruppi funzionali H C H OH H alcol metilico H H C H COH H H alcol etilico

Modalità di misura IR Linterazione tra la radiazione IR e il campione può essere in assorbimento, in trasmissione oppure in riflettanza Campo spettrale utilizzato: m ( cm -1 ) m ( cm -1 ): vicino IR (NIR) m ( cm -1 ): vicino IR (NIR) m ( cm -1 ): medio IR (MIR) m ( cm -1 ): medio IR (MIR) m ( cm -1 ): lontano IR (FIR) m ( cm -1 ): lontano IR (FIR)

Lo spettro IR di un campione si ottiene irraggiando il campione stesso con un intervallo più o meno ampio di nella regione dellinfrarosso; le assorbite corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole presenti nel campione. La risposta può essere visibile sotto forma di spettro di assorbimento. Nella figura è mostrato lo spettro IR di una sostanza pura (vanillina), irraggiata con un intervallo di tra 2.5 e 20 µm (o compresa tra 4000 e 500 cm -1 ) Esempio di spettro IR Il 100% della scala di trasmittanza (%T) corrisponde ad assorbimento nullo; al contrario, lo 0% indica che la sostanza assorbe totalmente la Il 100% della scala di trasmittanza (%T) corrisponde ad assorbimento nullo; al contrario, lo 0% indica che la sostanza assorbe totalmente la

Spettro IR del vino composti presenti nel campione: i picchi a 1450 e 1950 nm sono assegnabili entrambi al gruppo -OH dellacqua e degli alcoli; la spalla a 1690 nm è dovuta ai gruppi -CH 3 (presenti in numerosi composti nel vino) e ai gruppi –CH di composti aromatici (anche essi in grande quantità nel vino) Spettro di assorbimento IR di un campione di vino bianco, registrato tra 450 e 2500 nm, quindi nella regione del cosiddetto NIR (Near Infrared o vicino infrarosso). I picchi evidenziati sono dovuti allassorbimento di

Spettroscopia UV-visibile Nella spettrofotometria UV-visibile il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di nella regione ultravioletto-visibile, cioè tra 150 e 800 nm; le assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni elettroniche, corrispondono a gruppi funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento

Spettro di assorbimento UV-visibile di una sostanza pura (aldeide p-dimetilamino cinnamica), irraggiata con un intervallo di tra 200 e 600 nm. Valori alti di assorbanza corrispondono ad assorbimenti di luce elevati. La banda a 395 nm rende conto del fatto che il composto è colorato in arancio, colore complementare rispetto al violetto che corrisponde alla regione spettrale interessata (~ 400 nm) Le bande di assorbimento UV sono in numero minore rispetto allIR, tuttavia è possibile utilizzarle per effettuare de Esempio di spettro UV-visibile Lo spettro UV-visibile di un campione si ottiene irraggiandolo con un intervallo più o meno ampio di nella regione tra 150 e 800 nm; le assorbite corrispondono a gruppi funzionali delle molecole presenti nel campione determinazioni quantitative secondo la legge di Lambert-Beer A = bC

Spettro UV-visibile del vino Spettro di assorbimento UV-visibile (linea più sottile) di un estratto da vino rosso contenente i composti fenolici; è mostrato anche il grafico della derivata prima dello spettro (linea più spessa), utile ad evidenziare i massimi di assorbimento Si osservano due bande principali a 538 e 280 nm: la prima (non a caso il vino ha colore rosso, complementare del verde che si trova in quella zona) è dovuta agli assorbimenti delle principali antocianine del vino, delfinidina, malvidina e petunidina, la seconda è dovuta a flavonoidi, alle procianidine e agli stessi antociani. Le spalle a 520 e 310 nm sono attribuibili alla cianidina, unantocianina di solito minoritaria

Analisi UV-visibile e IR del vino Le tecniche spettroscopiche di assorbimento UV-visibile e IR, combinate con lanalisi multivariata dei dati, possono essere impiegate nella classificazione dei vini. Gli spettri di assorbimento danno indicazioni sui composti presenti nel campione, ma in questo caso le variabili non sono i composti, bensì gli assorbimenti dei campioni alle varie utilizzate. Se lo spettro di assorbimento è registrato tra, poniamo, 200 e 800 nm, si seleziona un certo numero di con un passo di 1 nm, alle quali misurare lassorbanza; in questo esempio si avrebbe un dataset composto da circa 600 variabili. Il numero effettivo di intervalli di può variare a seconda della necessità di valutare spettri più o meno definiti Il vantaggio di poter applicare un simile metodo consiste nel fatto che registrare uno spettro UV o IR è generalmente più semplice e rapido che effettuare una separazione cromatografica o una determinazione elementare