Lo studio delle correnti ioniche di singolo canale mediante la tecnica del patch-clamp

La tecnica del patch clamp Era noto da lungo tempo che attraverso la membrana plasmatica è possibile un rapido scambio di ioni. Tuttavia, Neher e Sakmann furono i primi a mostrare l’esistenza di canali ionici specifici La tecnica del patch clamp Erwin Neher & Bert Sakmann Premi Nobel per la medicina nel 1991 per lo sviluppo della tecnica del patch-clamp rendendo possibile la caratterizzazione di singoli canali ionici

Per chiarire come funziona un canale ionico, cioè come esso si apre e si chiude, è necessario poter registrare la corrente che lo attraversa. Antecedentemente all’era del patch-clamp ciò appariva elusivo in quanto la corrente ionica attraverso un singolo canale è molto piccola. Con la tecnica del patch-clamp si poterono superare tali difficoltà.

Il setup per il patch-clamp microelettrodo microscopio micromanipolatore computer preparato oscilloscopio gabbia di Faraday amplificatore

La configurazione di cell-attached

Registrazione di una corrente elettrica che fluisce attraverso un singolo canale ionico Amplificatore Elettrodo di registrazione: micropipetta di vetro  10-6 m Resistenza della saldatura: >1 GW Con un opportuno equipaggiamento elettronico e opportune condizioni sperimentali è possibile misurare questa corrente “microscopica” Quando un singolo canale si apre, gli ioni si muoveranno attraverso il canale come una corrente elettrica

Quale tipo di informazioni è possibile ottenere dalla registrazione di correnti di singolo canale?

Ampiezza media di singolo canale

Ampiezza media della corrente attraverso un singolo canale 20 ms 1 pA Chiuso Aperto Traccia di corrente attraverso un singolo canale Causa la presenza di un rumore di fondo che è riducibile ma non eliminabile, l’ampiezza della corrente che fluisce attraverso un singolo canale è soggetta a fluttuazioni. Di essa è pertanto possibile conoscere solo il suo valore medio Il calcolo di tale valore richiede la costruzione di un istogramma di ampiezza derivato dalla registrazione di singolo canale

Costruzione di un istogramma di ampiezza Chiuso 1 pA Aperto 20 ms 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 200 400 600 800 1000 Numero degli eventi Ampiezza (pA) Occorre una lunga registrazione di singolo canale Si misurano le ampiezze di tutte le aperture Tali ampiezze vengono riportate in un grafico (istogramma di ampiezza) ll dominio dell’ampiezza (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi ampiezza corrispondente m=1.7 pA La larghezza dell’istogramma dipende dal rumore di fondo della registrazione L’andamento dell’istogramma può essere descritto da una funzione gaussiana del tipo: dove: m = ampiezza media di corrente s = deviazione standard A = area della distribuzione

La relazione corrente-voltaggio a canale aperto è generalmente lineare Misurando le correnti di singolo canale è possibile costruire la relazione I-V a canale aperto -30 mV 0 mV +40 mV -100 mV La relazione corrente-voltaggio a canale aperto è generalmente lineare iopen single = γ (V-EK) La “conduttanza di singolo canale (g)” è un parametro biofisico caratteristico di un certo tipo di canale

Probabilità di apertura

Cos’è la probabilità di apertura? Chiuso Aperto A1 A8 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A9 A10 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 vale a dire,

Tracciati di singolo canale che mostrano Po diverse chiuso 0.1 aperto chiuso 0.25 aperto chiuso 0.5 aperto chiuso 0.75 aperto chiuso 0.9 aperto

Po nel caso di un canale voltaggio-dipendente: Essa varia al variare del potenziale -30 mV 0 mV +40 mV -100 mV

Currente, conduttanza, e voltaggio I = N·P·i I = corrente “macroscopica” N = numero di canali funzionali P = probabilità che un canale sia aperto i = corrente attraverso un singolo canale aperto i =  (V – VR)  = conduttanza del singolo canale aperto V = potenziale di membrana VR = potenziale di inversione I = N·P· (V – VR) I = g (V – VR) Corrente = Conduttanza  Driving force g = Conduttanza “macroscopica” g = N p  se  è costante, g è proporzionale a P I = g (V – VK)

Quale altro tipo di informazione può dare l’analisi delle correnti di singolo canale? Il numero degli stati in cui il canale può esistere Il tempo medio di permanenza in ciascun stato Le velocità di transizione tra gli stati

I tre tracciati mostrano la stessa probabilità di apertura ma cinetiche diverse chiuso aperto chiuso aperto chiuso aperto

Durata delle aperture e delle chiusure 100 ms 1 pA Chiuso Aperto Traccia di corrente attraverso un singolo canale ottenuta ad un potenziale fisso senza alcun tipo di sollecitazione (stato stazionario). La corrente passa frequentemente dall’uno all’altro di due distinti livelli il canale pur in condizioni stazionarie può trovarsi in almeno due stati conformazionali : chiuso e aperto La traccia mostra una notevole variabilità nella durata delle aperture e delle chiusure Non è possibile prevedere quanto tempo il canale rimarrà in ciascun stato funzionale (chiuso o aperto), né quando avverrà la successiva transizione: Siamo di fronte a variabili casuali (stocastiche) Le leggi che le governano possono essere dedotte dalla distrubuzione di probabilità di un elevato numero di eventi (aperture e chiusure)

Come ricavare la distribuzione di probabilità delle aperture e delle chiusure Occorre una lunga registrazione di singolo canale Si misurano le durate di tutte le aperture (e chiusure) Tali durate vengono riportate in un grafico (istogramma di durata) ll dominio temporale (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi durata corrispondente 100 ms Chiuso Aperto Tempi di chiusura 20 40 60 80 100 120 140 200 300 400 500 Numero degli eventi Durata chiusure (ms) Tempi di apertura 5 10 15 20 25 30 50 100 150 200 250 300 350 Numero degli eventi Durata aperture (ms) ∑chiusure=950 ∑aperture=950

Notare l’andamento decrescente delle due distribuzioni: Tempi di apertura 5 10 15 20 25 30 50 100 150 200 250 300 350 Numero degli eventi Durata aperture (ms) Tempi di chiusura 40 60 80 120 140 400 500 Durata chiusure (ms) Notare l’andamento decrescente delle due distribuzioni: gli eventi di breve durata sono i più frequenti gli eventi più lunghi sono via via sempre meno numerosi t=26 ms t=8 ms Le due distribuzioni delle durate sono ben descritte da funzioni del tipo: dove: N(t) = numero di aperture comprese tra (t-0.5dt) e (t+0.5dt) dt =intervallo in cui è suddivisa l’ascissa a e t sono costanti tipiche del canale In particolare, t =costante di tempo è un indice di quanto rapidamente la distribuzione declina verso zero: è il tempo a cui la distribuzione è il 37% del suo valore iniziale Nel caso di uno schema cinetico a due stati (C↔O) a=1/t

C a b O Come sono correlati i tempi di permanenza e le costanti di velocità nel caso di un modello a due stati? Tempo Medio di Apertura (MOT o to) = 1/b  Tempo medio di chiusura (MCT o tc) = 1/a Per esempio, se a = 250 s-1 e b = 1000 s-1, allora la durata media dei soggiorni nello stato aperto sarà 1/b = 1 ms e la durata media di soggiorni nello stato chiuso sarà 1/a = 4 ms Cioè: Il tempo medio che il canale trascorre in un particolare stato (il soggiorno in quello stato) e’ il reciproco della costante di velocità di transizione che porta fuori da quello stato. Si può dimostrare che:

Quindi, in uno schema cinetico a 2 stati: MOT=1/b e MCT=1/a La frazione di tempo che il canale trascorre in uno dei due stati dipende da entrambe le costanti di velocità a e b. Pertanto: Fraz. di t nello stato aperto = Se misuriamo un gran numero di tempi di apertura successivi, che tipo di distribuzione osserviamo? Supponiamo che un canale aperto abbia una probabilità P= 0.3 di chiudersi nei successivi 0.1 ms. Allora, misurando 1000 aperture, circa 700 volte si avrebbero aperture con un to>0.1ms, ecc.

Quando il canale è aperto vi è una probabilità costante che esso cambi il suo stato da O a C in un breve e definito intervallo di tempo dt, indipendentemente da quanto a lungo già si trovava nello stato O, o da come ci era arrivato. Supponiamo per esempio che esista una probabilità P=0.3 che la transizione avvenga nei successivi 0.1 ms. Ciò significa che possiamo fare predizioni statistiche circa il cambiamento da O a C. Avendo osservato un gran numero di canali aperti, circa nel 30% di essi il cambiamento a C sarà avvenuto nei primi 0.1 ms. Quindi, dopo 0.1 ms il 70% di essi è ancora nello stato O. Nei successivi 0.1 ms, un ulteriore 30% del rimanente 70% cambierà a C, e così via. Processi con tali caratteristiche, che la probabilità di un particolare cambiamento rimane costante in piccoli intervalli di tempo successivi, sono esempi di processi Markoviani.

Canali con più stati chiusi distinguibili Chiuso Aperto 5 10 15 20 25 30 50 100 150 200 250 300 350 Numero aperture Durata aperture (ms) Tempi di apertura 10 20 30 40 50 60 100 150 200 250 300 350 Numero chiusure Durata chiusure (ms) Tempi di chiusura t=8 ms t1=2.3 ms a1=0.4 t2=25 ms a2=0.6 Schemi cinetici possibili: In questo caso le relazioni tra i tempi medi di apertura e di chiusura e le costanti di velocità dipendono dallo schema cinetico scelto C1 C2 O C1 O C2

Frequenza di campionamento Filtraggio dei segnali Importanza di: Frequenza di campionamento Filtraggio dei segnali nella registrazione di correnti di singolo canale Seguiranno esempi di tracciati mostranti la perdita di informazione con una frequenza di campionamento bassa o con un filtraggio eccessivo

Effetto del filtraggio su un tracciato di corrente di singolo canale Traccia filtrata a 10000 Hz Traccia filtrata a 1000 Hz 4 ms 0.5 pA In pratica per correnti di singolo canale il filtraggio analogico del segnale è normalmente compreso tra 5 e 3 KHz

Effetto della frequenza di campionamento su un tracciato di corrente di singolo canale Freq. camp. = 0.1 ms/punto Freq. camp. = 0.4 ms/punto 4 ms 0.5 pA Teorema del campionamento: i dati dovrebbero essere campionati ad una frequenza almeno doppia di quella della banda passante

Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e biologi molecolari Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel processo di apertura/chiusura.

Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico Gene (DNA) Ipotesi circa una importante catena laterale Vengono mutati i codons desiderati RNA o cDNA Viene fatta “esprimere” la proteina con una catena laterale alterata misura