Metodi in Neuroscienze II

In base a ciò che ci si prefigge di studiare diventa molto importante la scelta del preparato (modello animale e/o cellulare) e del suo grado di complessità

Cervello isolato

Cervello intero isolato di porcellino d’india

Studi effettuati: - anatomici - immunoistochimici - vascolari - farmacologici - elettrofisiologici Vantaggi rispetto alla slice: - Circuiti corticali interamente preservati Svantaggi: - possibilità di registrare artefatti - registrazioni intra- ed extracellulari ma solo in current-clamp

Probe al silicio a 32 canali Probe al silicio a 16 canali Esempi di probes a multielettrodi utilizzati per la registrazione contemporanea da diversi strati di tessuto Probe al silicio a 32 canali Probe al silicio a 16 canali 50 µm 750 µm 1550 µm

Registrazione dalla corteccia con un probe multielectrode

Sezione di cervelletto Slices Sezione di cervelletto

Preparazione di una slice di ippocampo 3

Registrazioni Extra- ed Intracellulari in una Slice di Ippocampo elettrodo di registr. intracellulare elettrodo di registr. extracellulare stimolo stimolo

Whole-cell Patch Clamp in slice o fettina di tessuto sottile

Neuroni isolati Dissociazione acuta di neuroni da tessuto adulto o embrionale Colture primarie (da embrione) Vantaggi rispetto alla slice: Soprattuto per indagini elettrofisiologiche - migliori voltage- e space-clamp; - migliore farmacologia; - possibilità di mantenere le cellule in coltura per giorni;

Linee cellulari stabilizzate di origine neuronale e non Biologia Molecolare Clonaggio ed espressione di geni Mutagenesi sito-diretta Biochimica Elettrofisiologia vantaggi Plasmide + cDNA NG108-15 SHSY-5Y HEK Transfez. Biologia Molecolare Elettofisiologia Clone esprimente stabilmente il gene transfettato whole-cell & single-chann.

Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e biologi molecolari Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel processo di apertura/chiusura.

Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico Gene (DNA) Ipotesi circa una importante catena laterale Vengono mutati i codons desiderati RNA o cDNA Viene fatta “esprimere” la proteina con una catena laterale alterata misura

Lab 1 Lab2 Lab 3 Lab 4 Linee cellulari Slices dissociazione acuta Colture primarie Patch-clamp Linee cellulari Patch-clamp