Amplificazione DNA Clonaggio PCR.

Presentazione sul tema: "Amplificazione DNA Clonaggio PCR."— Transcript della presentazione:

1 Amplificazione DNA Clonaggio PCR

2 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

3 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

4 sito di restrizione Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

5 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

6 Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

7 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

8 Uso degli enzimi di restrizione
Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)

9 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

10 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

11 Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni
Minicromosomi artificiali

12 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

13 Vettori plasmidici

14 Elementi di un vettore plasmidico
Origine di replicazione Marcatore di selezione Sito di restrizione unico

15 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

16 Preparazione del DNA da clonare
Digestione clone già esistente DNA specifico PCR frammentato con enzimi di restriz. Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte frammentazione meccanica Collezione DNA (banca, genoteca) cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dell’mRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta

17 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

18 PREPARAZIONE del cDNA RNA DNA
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19 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

20 Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare
mediante ligasi di estremità coesive VETTORE  GAATTC CTTAAG  G CTTAA AATTC EcoRI  GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI INSERTO

21 Unione, mediante ligasi,
di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG VETTORE GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC EcoRI G CTTAA AATTC INSERTO GAATTC CTTAAG DNA ligasi

22 Reazione di ligasi strategie controlli

23 Clonaggio con singola digestione trattamento del vettore con fosfatasi
 G CTTAAp pAATTC  G CTTAA AATTC fosfatasi  G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI  GAATTC CTTAAG

24 Clonaggio con doppia digestione
EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA  G CTTAA AGCTT A  AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA

25 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

26 Introduzione del DNA nella cellula ospite
Trasformazione: CaCl2 Elettroporazione In E.coli Impacchettamento e infezione fagica Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi In cellule di Elettroporazione eucarioti superiori Microiniezione DNA gun

27 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

28 Vettori plasmidici

29 Strategie di selezione nel clonaggio
resistenza AMPICILLINA AMPICILLINA

30 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

31 1200 bp SacI EcoRI

32 Isolamento acidi nucleici
lisi cellulare deproteinizzazione concentrazione

33 Purificazione acidi nucleici
Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi etanolo (Na, NH4) isopropanolo

34 Purificazione acidi nucleici

35 Purificazione acidi nucleici

36 Isolamento DNA plasmidico
Protocollo “artigianale” Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

37 Protocollo artigianale
Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE

38 Analisi acidi nucleici
Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

39 1 OD260=50g/ml Spettro di assorbimento del DNA Assorbanza (OD)
220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0

40 Elettroforesi di acidi nucleici
Gel di agarosio Gel di acrilammide

41

42

43 Elettroforesi su gel di agarosio

44 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

45 al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.
Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

46 Fattori che influenzano la migrazione
Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

47 Visualizzazione del DNA

48 Marcatori di peso molecolare
 HindIII

49 ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2006/2007
Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio: 1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate 2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione 3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati

50 1200 bp SacI EcoRI

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52 Metodi di lisi cellulare
Tecnica Applicazione Metodi non meccanici Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri Enzimi litici Cellule animali e vegetali Detergenti (NP40, SDS) Cellule in coltura, batteri Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti Sfere di vetro Batteri e funghi Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistente Estrusione liquida (French press) Microorganismi Ultrasonicazione

53 Vettori procariotici Col E1 pSC101 naturali pBR322 pUC8 Plasmidi
Fagi Cosmidi naturali artificiali Col E1 pSC101 pBR322 pUC8 pEMBL8 lambda M13