Analisi Biochimico-Cliniche Fattori pre-analitici

La fase preanalitica preparazione del paziente raccolta trasporto Serie di procedimenti: preparazione del paziente raccolta trasporto conservazione manipolazione del campione biologico, trasferimento di una sua aliquota nella miscela di reazione.

La fase preanalitica A questi procedimenti partecipano più operatori, spesso eterogenei, appartenendo in parte ai reparti di degenza o al personale addetto agli ambulatori, in parte al personale del laboratorio.

Preparazione del paziente Possono influenzare la concentrazione di alcuni analiti: il tipo d’alimentazione l’assunzione di bevande alcoliche di farmaci lo stress l’affaticamento

L’alimentazione Influenza assunzione di carboidrati nei giorni precedenti sulla prova di tolleranza al glucosio: una dieta ricca in carboidrati è causa di un appiattimento della curva glicemica; viceversa, una dieta povera di carboidrati la esalta.

L’alimentazione Il tenore in grassi della dieta può influenzare la concentrazione plasmatica dei componenti lipidici del sangue. Pasto ricco in trigliceridi può fortemente influenzare la trigliceridemia fino ad aumentarla del 100%, anche dopo un digiuno di 12 ore, tempo normalmente sufficiente per portare tutti gli analiti in condizioni basali. Pasto ricco di colesterolo influenza poco la colesterolemia misurata il giorno dopo: non più del 2-3%.

L’alimentazione Incremento fosfatasi alcalina da 2-4 ore dopo il pasto, dovuto ad un  dell’isoenzima intestinale. Alto consumo di acidi grassi insaturi dà luogo ad una  colesterolemia (applicazioni terapeutiche). Escrezione urinaria di acido 5-idrossiindolacetico  nel caso di ingestione di abbondati quantità di banane, pompelmi e dolci contenenti vaniglia.

Assunzione di bevande alcoliche L’alcol ha l’effetto di , anche a breve termine, lattato, acido urico e a lungo termine l’attività di diversi enzimi plasmatici come la AST e la -GT (dopo 60 ore ancora valori elevati). Anche la trigliceridemia e l’HDL aumentano considerevolmente nell’abuso cronico di alcol.

I farmaci Farmaco può avere attività biologiche collaterali che causano modificazioni della concentrazione di uno o più analiti, oltre all’effetto che il farmaco si prefigge. I metaboliti possono essere causa di interferenze biologiche.

I farmaci Interferenza di natura fisico-chimica sul procedimento analitico. Farmaco, o suo catabolita, si combina all’analita da misurare, oppure vera e propria interferenza verso le reazioni del procedimento analitico Le attività degli enzimi plasmatici, e così pure i procedimenti analitici basati su reazioni enzimatiche, sono particolarmente esposte alla interferenza da farmaci.

L’esercizio muscolare Se intenso e su individui non allenati, causa modificazioni della concentrazione di molti parametri di laboratorio. Questi effetti possono essere transitori rapida diminuzione, e seguente aumento, nella concentrazione degli acidi grassi liberi, marcato aumento dell’alanina e dell’acido lattico (triplicato). duraturi variazioni a carico degli enzimi plasmatici: CK, aldolasi, LDH, transaminasi; l’attività della CK può risultare raddoppiata nelle 12-30 ore dopo attività sportiva intensa e ancora dopo 50 ore si può riscontrare un aumento fino al 40%.

L’esercizio muscolare Altre modifiche dovute ad esercizio prolungato si riferiscono agli ormoni sessuali: dopo 6 mesi di allenamento il testosterone, l’androstenedione e l’LH aumentano del 20-25%.

Digiuno Digiuno prolungato, più di 24 ore, può determinare inaspettate variazioni dei dati di laboratorio: la bilirubina aumenta di due volte dopo un digiuno di 48 ore, la glicemia dopo tre giorni si attesta su valori sotto i 50 mg/dL, la concentrazione di trigliceridi, acidi grassi e glicerolo aumenta senza contemporanei aumenti del colesterolo.

Effetto della postura Passaggio dalla posizione supina alla posizione eretta ha come conseguenza la fuoriuscita di acqua e componenti filtrabili dal compartimento vascolare a quello interstiziale; Componenti non filtrabili, (proteine, enzimi, calcio, il ferro legati alle proteine ecc.) divengono più concentrati nel plasma. Significative variazioni tra i pazienti ambulatoriali e quelli in regime di degenza

Modalità del prelievo puntura venosa, puntura arteriosa e Tra i liquidi biologici, il sangue è di gran lunga il più comunemente usato nel laboratorio di analisi. Le procedure per ottenerne un campione sono tre: puntura venosa, puntura arteriosa e puntura della pelle, quest’ultima per ottenere il cosiddetto sangue "capillare”

Raccolta e trattamento dei campioni: sangue venoso Sangue venoso: Usato per le indagini chimico cliniche. Povero in O2 e differisce nella concentrazione di CO2 e nel pH; glucosio, ammonio e lattato variano a seconda delle necessità dei tessuti irrorati da cui il sangue deriva.

Modalità del prelievo: prelievo venoso La stasi venosa mediante laccio emostatico, necessario per evidenziare le vene e facilitare il prelievo, può essere causa di errori preanalitici, se la stasi si protrae per > 1-2 minuti: fuoriuscita di acqua e di sostanze filtrabili, secondaria all’aumento della pressione nel vaso, e l’ipossia. Stasi prolungata, associata ad esercizio fisico della mano, aggiunge a emoconcentrazione effetto metabolico (di ioni idrogeno del 30%, di acido lattico di oltre il 100%, di sodio del 3%, di potassio del 15%)

Modalità del prelievo: prelievo venoso Limitare a non oltre un minuto la stasi venosa!! (segnalare al laboratorio le situazioni di prelievo difficoltoso). Campione di sangue prelevato dalla vena mediana o dalla vena cubitale profonda, o in caso di necessità da una vena del dorso della mano.

Raccolta e trattamento dei campioni: sangue arterioso Sangue arterioso: ossigenato, usato per lo studio dei parametri dell’equilibrio acido-base e della tensione dei gas presenti nel sangue (ossigeno, anidride carbonica) per aver informazioni preziose sulla funzionalità respiratoria. Composizione costante in tutti i distretti del corpo.

Raccolta e trattamento dei campioni: sangue arterioso L’esecuzione del prelievo è molto più laboriosa (e anche più dolorosa) di quella del sangue venoso  personale addestrato. Deve essere conservato nella stessa siringa del prelievo, con l’ago tappato per evitare modificazioni del contenuto dei gas presenti nel sangue a causa di scambi con l’aria. Evitare che all’interno del campione vi siano bolle d’aria.

Modalità del prelievo: prelievo arterioso Immediatamente dopo il prelievo, la siringa o il capillare contenente il campione devono essere inviati al laboratorio in un contenitore con acqua e ghiaccio, allo scopo di rallentare il metabolismo delle cellule del sangue che in breve tempo altererebbe sia il pH sia il contenuto dei gas del sangue.

Raccolta e trattamento dei campioni: sangue "capillare“ Sangue "capillare“: Ottenuto per puntura della pelle ai bambini piccoli, ai soggetti con profonde ustioni, ai soggetti obesi e a diabetici sono sottoposti a continui prelievi. Negli adulti può essere ottenuto dal lobo dell’orecchio o dal polpastrello di un dito, nei neonati dal calcagno. Miscela di sangue di derivazione arteriolare, venulare e capillare, oltre alla presenza di liquido interstiziale.

Disinfezione Indispensabile per la parte ove avverrà il prelievo: sostanze efficaci e che non diano luogo a fenomeni di interferenza per l’esame richiesto. Alcol al 70% si è dimostrato efficace e viene ampiamente usato anche se presenta qualche rara limitazione, come nel caso di dosaggio dell’alcolemia.

Strumenti per il prelievo di sangue Lancette, aghi, siringhe, cannule, cateteri, pipette, provette di vetro e di plastica, sistemi siringa-contenitore a circuito chiuso sotto vuoto (tipo vacutainer). Devono essere sterili, chimicamente inerti, molto efficienti per quanto riguarda la penetrazione attraverso la cute e, conseguentemente, poco traumatizzanti.

Sangue intero senza anticoagulanti. Siero Sangue intero senza anticoagulanti. La coagulazione coinvolge la parte corpuscolata e i fattori plasmatici della coagulazione

Siero Cellule inglobate nel coagulo subiscono danni e inducono la liberazione di parte del contenuto cellulare. Variazione significativa di alcuni parametri biochimici nel siero rispetto al plasma. Concentrazione del potassio, fosfatasi acida e la lattico deidrogenasi >rispetto a quella del plasma.

Plasma Sangue intero con anticoagulanti contiene il fibrinogeno e i fattori della coagulazione. Non risente del trauma della coagulazioneno emolisi.

Plasma Indispensabile per la misura dei fattori della coagulazione e per l’esame emocromocitometrico e la velocità di eritrosedimentazione. Più adatto nell’urgenza, ottenuto rapidamente per centrifugazione del campione senza attendere il tempo necessario alla coagulazione.

Anticoagulanti e conservanti

Eparina Mucopolisaccaride acido il cui PM varia moltissimo a seconda della preparazione. Esiste come sale di potassio e di sodio,di litio o di ammonio. Inibisce la trombina e altri fattori della coagulazione.

Eparina Dotata di un PM elevato è l’anticoagulante ideale qualora si voglia misurare la osmolalità plasmatica o studiare la fragilità osmotica eritrocitaria. Non utilizzabile per indagini coagulative, dosaggio del litio o dell’ammonio, calcio e magnesio. Forma complessi non rilevabili dagli elettrodi ionosensibili.

EDTA Acido etilendiamminotetraacetico il più frequentemente usato. Azione anticoagulante: sequestra lo ione calcio che diventa indisponibile per le reazioni della cascata coagulativa che rimane così inibita. Pur essendo l’anticoagulante di scelta per l’emocitometria, già dopo 3-4 ore dal prelievo, il sangue raccolto su EDTA non è più idoneo per studi morfologici.

EDTA Potente inibitore di molti enzimi eritrocitari, leucocitari, piastrinici e plasmatici, non consente misure dell’attività di questi come pure dell’attività piastrinica. Non usare per la determinazione degli elementi pesanti come ferro e rame perché anch’essi vengono sequestrati.

Altri anticoagulanti Citrato. Il citrato di sodio viene impiegato per la misura della VES, per lo studio dei fattori della coagulazione e della funzionalità piastrinica. Ossalato. Ossalato doppio di ammonio e di potassio, è il chelante del calcio usato più raramente.

Altri anticoagulanti Sostanze stabilizzanti. Mantengono inalterata nel tempo la concentrazione di sostanze da dosare. Per esempio, i fluoruri o il monoiodioacetato, che inibiscono la glicolisi, trovano impiego quando non si possa dosare il glucosio in tempi brevi dal prelievo.

Anticoagulanti e conservanti La presenza dell’anticoagulante in soluzione, diluisce il campione: rispettare sempre il rapporto raccomandato tra volume di anticoagulante e volume di campione. Diffusione di prelievo con contenitori sotto vuoto ha contribuito in maniera sostanziale alla risoluzione di questi problemi.

Anticoagulanti e conservanti Uso di gel separatori, che con la centrifugazione del campione si interpongono tra il siero e la parte corpuscolata del sangue, migliora la conservazione degli analiti e previene interferenze dovute al contatto delle cellule con alcuni analiti del plasma, glucosio che viene consumato dal metabolismo cellulare e per il potassio che può aumentare nel plasma per la fuoriuscita dagli elementi cellulari.

Trasporto e conservazione Dalla sede di raccolta al laboratorio, è importante rispettare le esigenze del tempo di conservazione degli analiti, e delle condizioni fisico-chimiche che possono alterarne la concentrazione. All’interno dell’ospedale il trasferimento avviene ad opera di infermieri o di personale specificamente incaricato dei trasporti interni.

Trasporto e conservazione I materiali provenienti dai reparti arrivano direttamente ai singoli laboratori oppure in una sede centralizzata per il processo iniziale di centrifugazione distribuzione ai laboratori di analisi.

Centrifugazione La separazione del siero e del plasma dalla parte corpuscolata è essenziale per la conservazione degli analiti che possono subire alterazioni in presenza delle cellule. fuoriuscita di potassio dalle cellule, dove si trova alla concentrazione di circa 150 mEq/L, al plasma, dove la sua concentrazione è di circa 4 mEq/L.

Centrifugazione Se non di separa immediatamente plasma o siero dalla parte corpuscolata è preferibile conservare il campione a temperatura ambiente piuttosto che in frigorifero. bassa temperatura rallenta i processi metabolici cellulari che mantengono attivamente il gradiente del potassio e di altri componenti tra il compartimento intracellulare e quello extracellulare.

Emolisi Rottura dei globuli rossi: liberazione del loro contenuto nel siero o nel plasma che di conseguenza assume una colorazione dal rosato al rosso in funzione della quantità di emoglobina liberata. Visibile per Hb> 200-300 mg/L. Normalmente Hb libera nel siero <50 mg/L e nel plasma <20 mg/L. Uno dei più importanti fattori che causano interferenze nelle determinazioni su campioni di siero e di plasma.

Cause di emolisi biologica meccanica chimica od osmotica fisica anemie emolitiche: fragilità corpuscolare, difetti della normale morfologia eritrocitaria (sferocitosi), deficienze di enzimi eritrocitari (glucoso-6-fosfato deidrogenasi, piruvico chinasi), emoglobinopatie, anticorpi acquisiti in seguito a trasfusioni (emolisine), eritroblastosi fetale, anemie emolitiche autoimmuni; infezioni, assunzione di farmaci ed effetto di agenti fisici (ustioni, protesi intracardiache, ecc.) meccanica aghi da prelievo troppo sottili, aspirazione eccessiva durante il prelievo di sangue, pressione troppo elevata sullo stantuffo al momento dell’espulsione del sangue dalla siringa quando non si toglie l’ago, agitazione troppo vigorosa della provetta chimica od osmotica presenza sulla pelle al momento del prelievo, nell’ago della siringa o nei contenitori di disinfettanti, detergenti, acqua o altre sostanze chimiche fisica conservazione del campione in condizioni non idonee: il congelamento provoca la cristallizzazione dell’acqua endoeritrocitaria la rottura delle membrane e quindi la lisi degli eritrociti

Torbidità Percepibile quando la concentrazione dei trigliceridi > i 400 mg/dL (lattescenza). Interferenza di natura spettrofotometrica assorbimento ottico aspecifico delle particelle in sospensione.

Torbidità Interferenza specifica in diversi procedimenti analitici particolarmente quelli che fanno uso di enzimi.  trigliceridi possono inibire l’attività dell’ureasi e dell’uricasi enzimi impiegati nel dosaggio dell’azotemia e dell’uricemia.

Evaporazione Causa aumento della concentrazione degli analiti: campione, separato dalla parte corpuscolata, viene trasferito in contenitori o coppette sullo strumento e rimane esposto all’aria: evaporazione!

Temperatura e umidità relativa Temperatura ambiente(21°-23°C), umidità relativa (60-70%), evitare eccessiva ventilazione dei locali. Per urine, abbassamento da 37°C alla T ambiente, e modificazioni del pH, causa precipitazione di sali come urati e fosfati che trascina altre sostanze e componenti cellulari.

Altri fattori preanalitici CO2 evapora dal plasma (campione tappato!) diminuzione di 5 mMol/L in un’ora, aT ambiente. Perdita CO2 causa un  pH del siero (pH8.5 in 2 h) e distruzione della fosfatasi acida.

Conservazione campioni Metodo ideale di conservazione: separazione dai globuli rapido raffreddamento a -80°C a -20°C dà identici risultati per un periodo di almeno 6 mesi. Alterata permeabilità delle membrane degli eritrociti portano ad un aumento della potassiemia quando il sangue non è separato dai globuli. Sangue a 4°C la perdita di potassio da eritrociti sarà maggiore per rallentamento pompa sodio-potassio.

La raccolta delle urine Estemporanea raccolto in ogni momento della giornata (prima minzione del mattino). A tempo la più comune è quella delle 24 ore (escrezione nelle 24 ore). Contenitori puliti di vetro o plastica, chiuso a tenuta ed etichettato (nome del paziente e il giorno della raccolta). Inviate al più presto al laboratorio per evitare modificazioni morfologiche dei componenti del sedimento, crescita di batteri ed alcalinizzazione del materiale: campione analizzato entro due ore.

La conservazione delle urine Conservare campione in frigorifero durante e dopo la raccolta in presenza diconservante chimico (acido borico, acetico cloridrico). lo sviluppo di flora batterica, anche in campioni apparentemente normali, può seriamente interferire con molti analiti come il pH, il glucosio, le proteine L’alcalinizzazione del campione, conseguente all’azione batterica, può infine alterare gravemente gli elementi figurati e in particolare i cilindri.

Conservazione dei campioni di urina Nel caso in cui vi sia sospetto di incompletezza della raccolta delle 24 h si può riferire il risultato ai grammi di creatinina contenuti nel campione, invece che alla diuresi.

La raccolta delle feci Indagini macroscopiche (aspetto, consistenza, presenza di muco o di pus), microscopiche (ricerca di fibre di carne, di residui vegetali, di grassi, di parassiti, di leucociti) e di carattere chimico (sangue). raccogliere in adatto contenitore pulito, evitando che alle feci possano mescolarsi le urine. Per la ricerca di parassiti, delle loro uova e di protozoi si devono utilizzare campioni di feci fresche; in caso di impossibilità, possono essere utilizzati conservanti.

La raccolta delle feci La ricerca del sangue occulto viene effettuato seguendo due principi: azione perossidasica dell’emoglobina (reazione di Mayer) per lo screening delle emorragie delle alte vie digestive; è necessario instaurare una dieta acarnea e priva di vegetali ricchi di perossidasi (ravanelli, rape, meloni, rafano, ecc.) per i tre giorni precedenti la raccolta e evitare l’assunzione di farmaci contenenti acido acetilsalicilico anticorpi anti-emoglobina umana per i sanguinamenti delle basse vie digestive. Evitare di deglutire il sangue da emorragie gengivali.

Liquido cefalorachidiano (liquor) Riempie tutti gli spazi lasciati liberi dall’encefalo e dal midollo spinale all’interno della dura madre. Prelievo (rachicentesi): lo spazio intervertebrale compreso fra la quarta e la quinta vertebra lombare (puntura lombare) o, più raramente, lo spazio compreso fra l’atlante e l’osso occipitale (puntura occipitale).

Liquido cefalorachidiano (liquor) È essenziale che i campioni siano consegnati in laboratorio entro un’ora e siano mantenuti fino a quel momento a temperatura ambiente, questo per conservare indenni le caratteristiche citologiche.

Liquidi di versamento nelle cavità sierose. Pleura, pericardio, peritoneo. L’analisi indicata nei casi di aumento del volume per cause trasudative (insufficienza cardiaca congestizia, cirrosi, nefrosi, mixedema, occlusioni vascolari, ecc.) od essudative (neoplasie, metastasi, polmoniti, pericarditi, tubercolosi, pancreatiti, traumi, malattie granulomatose, ecc.).

Liquido sinoviale Ultrafiltrato plasmatico prodotto dalle cellule che rivestono internamente la membrana sinoviale delle grosse articolazioni; ha una funzione lubrificante e nutritiva nei confronti delle cartilagini che rivestono i capi articolari delle ossa.

Liquido sinoviale In condizioni normali la quantità prelevabile è molto ridotta e il liquido è altamente vischioso. In condizioni patologiche si assiste a tumefazione articolare sostenuta dall’aumento della quantità di fluido intra-articolare. Lo studio del liquido intra-articolare può fornire informazioni determinanti per l’orientamento diagnostico e terapeutico.

Altri liquidi biologici Liquido amniotico. Consente di valutare la funzionalità e la maturità di organi ed apparati fetali (urinario, digerente, respiratorio), rivelare malformazioni fetali ed accertare precocemente eventuali malattie genetiche. Liquido seminale. Prima della raccolta del liquido seminale è necessario un periodo di astinenza sessuale di 3-5 giorni. La raccolta deve avvenire per masturbazione e il campione deve essere esaminato circa 30 minuti dopo; se non è possibile, deve essere conservato a 37°C ed esaminato comunque entro due ore.

Altri liquidi biologici Succo gastrico. Sospesa l’assunzione di qualunque farmaco 24 ore prima dell’esame, paziente deve essere digiuno da 12 ore. Dopo l’introduzione del sondino, il campione viene aspirato con la siringa. Si ripete la procedura dopo stimolazione con il farmaco prescelto. Sudore. Nel 99% dei pazienti affetti da fibrosi cistica si riscontra un aumento della concentrazione del cloruro di sodio nel sudore. Per raccogliere il sudore è necessario procedere alla stimolazione locale delle ghiandole sudoripare con pilocarpina. Dopo 30’ si procede alla raccolta del campione su carta da filtro o con micropipetta.

Criteri di non accettabilità dei campioni biologici Identificazione assente Identificazione incompleta Mancanza di informazioni necessarie per l’esecuzione dei test Contenitore inidoneo (non conforme alle indicazioni o necessità del laboratorio, non sterile e/o a imperfetta chiusura, non esente da metalli in tracce, ecc) Contenitore non integro Prelievo non corretto (effettuato durante terapia infusionale, senza impiego di terreni di trasporto, ecc)

Criteri di non accettabilità dei campioni biologici Quantità insufficiente Rapporto sangue/anticoagulante inadeguato o scorretto Mancata aggiunta di idoneo conservante Presenza di coaguli (per esempio emocromo, test coagulativi) Emolisi evidente Conservazione a temperatura non corretta (emogasanalisi, ammoniemia, ecc)

Criteri di non accettabilità dei campioni biologici Esposizione a luce solare diretta Congelamenti e scongelamenti ripetuti Paziente non a digiuno per esami come glicemia e/o lipidemia Paziente non sottoposto al previsto regime dietetico (per esempio sangue occulto) Pazienti non a riposo per test in cui il riposo è indispensabile (per esempio dosaggio renina)

Accettazione e centrifugazione All’arrivo in laboratorio, il materiale è controllato per verificare se sono state adottate tutte le misure preanalitiche necessarie alla sua integrità. In caso contrario i campioni saranno respinti Il reparto di provenienza deve essere prontamente avvisato della inidoneità del materiale e della necessità di un altro campione. Il campione di sangue va quindi centrifugato per ottenere il siero (dopo 30’ a T ambiente) o plasma.

La centrifugazione Eseguita a 1100 x g per 15' oppure a 3000 x g per 10’. Il numero dei giri per minuto da impostare sulla centrifuga può essere calcolato per ogni centrifuga con la formula: g = 1.118 x 10-5 x r x n2 ove : r = raggio in cm del braccio della centrifuga; n = numero di giri per minuto

La centrifugazione Le provette vanno tenute obbligatoriamente tappate, per motivi di sicurezza, in ogni fase della manipolazione del campione. Al momento opportuno il tappo va tolto con molta precauzione per evitare sia spargimenti di materiale potenzialmente dannoso per l’operatore, sia il rimescolamento delle fasi separate.

La centrifugazione Migliore separazione dei globuli da siero o plasma, si possono usare delle barriere fisiche che si interpongono tra le due fasi: da granuli o gel già presenti nelle provette, o aggiunti prima della centrifugazione, costituiti di materiale con una densità intermedia, che durante la centrifugazione vanno a disporsi tra i globuli e la parte liquida. La presenza di questi separatori migliora indirettamente la conservabilità del campione.