estrazione, caratterizzazione, ruolo biologico, usi Consiglio Nazionale delle Ricerche Istituto di Chimica Biomolecolare – Catania OLI ESSENZIALI: estrazione, caratterizzazione, ruolo biologico, usi Giuseppe Ruberto Catania, 22 Marzo 2011

Consiglio Nazionale delle Ricerche Istituto di Chimica Biomolecolare Catania

Le piante accumulano gli oli essenziali in cellule specializzate che Per OLIO ESSENZIALE si intende una complessa miscela di svariati componenti ottenuta esclusivamente mediante distillazione/idrodistillazione da una matrice vegetale. L’unica eccezione è presentata dagli oli essenziali di agrumi che sono ottenuti mediante procedimenti meccanici. Sono chiamati anche oli volatili in quanto diffondono facilmente nell’aria dove sono percepiti dall’olfatto. www.anbg.gov.au www.ehow.com http://aidanbrooksspices.blogspot.com Foglia di Eucalipto Foglia di Coriandolo Buccia di agrumi Le piante accumulano gli oli essenziali in cellule specializzate che possono trovarsi su foglie, fiori, frutti, rami, corteccia, radici

ORGANISMI VIVENTI Metabolismo Primario Metabolismo Secondario carboidrati lipidi proteine acidi nucleici coenzimi vitamine Metabolismo Secondario alcaloidi antrachinoni flavonoidi polifenoli steroidi terpeni Oli essenziali

La funzione degli oli essenziali è ancora materia di discussione… RUOLO BIOLOGICO DEGLI OLI ESSENZIALI La funzione degli oli essenziali è ancora materia di discussione… Come molti altri prodotti secondari, gli oli essenziali sono stati per lungo tempo considerati prodotti di scarto. Tuttavia, i percorsi biosintetici che portano alla loro formazione sono altamente specializzati, e la loro produzione implica una notevole “spesa” energetica da parte della pianta. Le conoscenze attuali dimostrano che essi possiedono un ruolo difensivo nei confronti degli erbivori e di prevenzione contro gli attacchi di agenti patogeni (batteri , funghi). Oltre a queste si ritiene svolgano azioni mollto più specialistiche quali la capacità di attrarre gli insetti impollinatori, o altri animali capaci di disperdere i semi, oppure difendere la pianta da stress ambientali (radiazione solare, siccità), e fungere da termoregolatori.

OLI ESSENZIALI COME SEMIOCHIMICI SEMIOCHIMICI (dal Greco semeon = signale) sono sostanze chimiche di segnalazione che un organismo può rilevare nel suo ambiente naturale e che modificano il suo comportamento. Si conoscono due classi di semiochimici: FEROMONI ed ALLELOCHIMICI, i primi coinvolti nella ‘comunicazione’ fra animali (principalmente insetti) della stessa specie, i secondi nelle relazioni interspecifiche pianta/pianta e pianta/insetto. Molti oli essenziali e/o loro componenti si comportano come allelochimici, che sulla base della funzione svolta possono essere suddivisi in: Allomoni: Sostanze che beneficiano l’emettitore ma non il ricevente (oli essenziali che “gocciolano” ai piedi di un albero impedendo la germinazione di altre piante). Kairomoni: Sostanze che beneficiano il ricevente ma non l’emettitore . Sinomoni: Sostanze che mediano una relazione mutualistica, beneficiando sia l’emettitore che il ricevente.

LA CHIMICA Gli oli essenziali sono di norma complesse miscele di decine di differenti composti organici volatili, quali idrocarburi, alcoli, acidi, esteri, aldeidi, chetoni, eteri, fenoli, composti azotati e solforati, ecc. I terpenoidi sono i componenti più frequentemente presenti, fenilpropanoidi ed idrocarburi sono altri importanti composti.

TERPENI C10 monoterpeni – O.E. C15 sesquiterpeni – O.E. C20 diterpeni – O.E. (rari) C30 triterpeni C40 tetraterpeni monoterpene monociclico diterpene triciclico sesquiterpene monociclico

I monoterpeni I monoterpeni sono fra i componenti più rappresentati, se ne contano più di 3500, in pratica sono rarissimi gli oli essenziali senza monoterpeni. Agrumi basilico timolo rosa damascena origano

Oltre ai terpenoidi, molti composti fenolici, quali i fenilpropanodi, sono responsabili dell’aroma di molte spezie. finocchio cannella chiodi di garofano Mentre molte acetogenine, provenienti dalla degradazione di composti lipidici (acidi grassi, carotenoidi) sono i componenti aromatici di molti comuni vegetali. pomodoro funghi

IL MERCATO DEGLI OLI ESSENZIALI Si stima che siano noti oltre 3000 oli essenziali, tuttavia solo 300 sono normalmente commercializzati. La produzione oscilla fra 20,000 – 30,000 tonnellate per gli oli di agrumi (arancia) a meno di 100 kg per alcuni estratti floreali. I prezzi oscillano fra 2 – 70 US$/kg, raggiungendo cifre molto alte per alcuni oli particolari Principali oli essenziali e prezzi: ton/year $/kg Arancia 26,000 2 Menta comune 4,300 25 Menta piperita 3,500 40 Eucalipto (cineolo) 3,300 10 Citronella 2,800 15 Limone 2,200 18 Eucalipto (citronellale) 2,000 8 Limetta (distillato) 1,000 18 Lavandino (ibrido) 800 20 Coriandolo 800 65 Pompelmo 700 15

Il caso paradossale dello olio di Iris radici 1 kg = 40.000-50.000 euro (!!!) L’olio essenziale di molte specie di Iris è ottenuto dalle radici dopo una ‘stagionatura’ di tre-cinque anni. Le radici fresche, infatti, non presentano olio essenziale che si forma dalla ”degradazione’ di alcuni precursori. Questo olio essenziale, dall’aroma simile a quello della violetta, è uno dei principali componenti di profumi molto pregiati.

Per esempio per ottenere un kg di olio essenziale sono necessari: 1.000 kg di fiori di arancio 600 kg di geranio 6 – 7 kg di chiodi di garofano

Le più importanti spezie ed i relativi oli essenziali dal punto di vista commerciale provengono dall’aria tropicale: Tropico del Cancro ginger pimento peperoncino noce moscata curcuma cardamomo chiodi di garofano cannella Tropico del Capricorno vaniglia I principali mercati sono gli Stati Uniti, la Comunità Europea, il Giappone, Singapore, l’Arabia e la Malesia. I principali paesi produttori sono la Cina, l’India, il Vietnam, il Brasile, il Guatemala e Ceylon.

…. e quelle delle zone temperate: basilico menta salvia zafferano timo origano Tropico del Cancro Tropico del Capricorno cumino agrumi sesamo coriandolo alloro

ESTRAZIONE ED ANALISI DEGLI OLI ESSENZIALI Gli oli essenziali, o le sostanze volatili presenti in una matrice vegetale, o quelle che si formano tramite una serie di trasformazioni (vedi analisi della matrice lipidica di molti alimenti), si ottengono sfruttando la loro caratteristica fondamentale, cioè di essere altamente volatili. Pertanto una distillazione o una idrodistillazione sono le metodiche più comunemente adottate. Solo in alcuni casi, come gli agrumi ad esempio, gli oli essenziali sono ottenuti meccanicamente. La stessa caratteristica, cioè l’elevata volatilità, condiziona anche il metodo di analisi. In questo caso la gascromatografia (GC) è la scelta obbligata.

Tempo balsamico per la raccolta di diverse parti di una pianta Organi Periodo Radice, tubero, rizoma, bulbo Autunno (prima della caduta delle foglie) Primavera (prima della gemmazione) Fusto (legno) Inverno (prima dello sviluppo delle gemme) Corteccia Autunno – primavera Gemma Primavera Fiore Primavera – estate Foglia Frutto Estate – autunno Seme

Come si ottengono gli oli essenziali da una matrice vegetale La metodica più comune per ottenere un olio essenziale è una variante della classica distillazione, nota come distillazione in corrente di vapore. Una metodica alternativa che sfrutta lo stesso principio è l’idrodistillazione. In casi particolari, il più noto dei quali è relativo agli agrumi, l’olio essenziale si ottiene meccanicamente, raschiando la parte esterna del frutto, il flavedo, dove sono localizzate le ghiandole oleifere, emulsionando con acqua e separando per centrifugazione. Una più recente metodica prende in considerazione i fluidi supercritici, in particolare l’anidride carbonica. Da molti considerata la migliore tecnica per ottenere un ottimo olio essenziale, ha il grosso svantaggio di essere particolarmente costosa.

Schema del processo di distillazione in corrente di vapore il vapore attraversa il materiale vegetale (in giallo) e distilla l’olio miscela vapore/olio acqua in uscita CONDENSATORE CALDAIA acqua fredda in entrata SEPARATORE ingresso vapore l’idrolato esce dalla parte inferiore del separatore olio essenziale raccolto nella parte superiore del separatore da www.galenotech.org/estratti.htm

Idrodistillatore In A si pone il materiale vegetale in acqua e si porta ad ebollizione, per ca. 2-3 ore. In B si raccoglie l’olio essenziale che si stratificherà sull’acqua, per essere quindi raccolto.

SPAZIO DI TESTA DINAMICO Gas inerte (elio/azoto) Cartuccia di materiale assorbente Bagno termostatato

Estrazione in vivo dell’aroma di un fiore

MICROESTRAZIONE IN FASE SOLIDA - SPME Dettaglio dell’iniettore Questa procedura è un estensione della estrazione in fase solida SPE. In questo caso una fibra adsorbente è posta in prossimità di un campione da analizzare, che è opportunamente riscaldato per favorire l’evaporazione delle sostanze volatili. Queste sono adsorbite sulla fibra, che può essere di varia natura per selezionare il materiale da estrarre. Ultimata la procedura di estrazione, lo strumento che altro non è che una siringa, è inserito nell’iniettore del gas cromatografo (GC). Per riscaldamento della fibra si ottiene il desorbimento del materiale adsorbito che è quindi analizzato. Dettaglio dell’iniettore del GC con inserita la siringa SPME Sistema SPME

OLI ESSENZIALI DI AGRUMI Procedimenti esclusivamente meccanici che prevedono l’ottenimento del succo e degli oli essenziali METODO F.M.C. METODO “SFUMATRICE”

ANALISI DEGLI OLI ESSENZIALI E DEGLI AROMI Densità ed indice di rifrazione sono due importanti parametri per stabilire la qualità di un olio essenziale, ma da soli non bastano. Per stabilire l’effettiva qualità di un olio essenziale, così come le possibili adulterazioni, è necessario ricorrere alla gas-cro- matografia abbinata a differenti rivelatori. GC-FID = Gas Chromatography – Flame Ionization Detector GC-MS = Gas Chromatography – Mass Spectrometry

CROMATOGRAFIA E’ una tecnica di separazione di miscele complesse, che si basa sulla competizione di due forze. Una che tende a trattenere le sostanze presenti nella miscela (detta Fase Stazionaria) e una che tende a farle muovere (detta Fase Mobile) La Fase Stazionaria è di norma un solido inerte su cui le sostanze tendono ad adsorbire. La Fase Mobile può essere un liquido o un gas che tende a trasportare le sostanze. Dato che ogni composto ha una sua particolare affinità sia per la fase stazionaria che per la fase mobile, modulando opportunamente queste due forze è possibile separare nei loro singoli componenti miscele molto complesse.

GASCROMATOGRAFIA Nella gas cromatografia la fase stazionaria è un supporto solido, la fase mobile è un gas (idrogeno, azoto, elio). La miscela tramite siringa è inserita nell’iniettore dove è vaporizzata (250 °C) passando quindi nella colonna inserita in un forno, in tal modo è possibile eseguire le analisi ad una temperatura ben definita (isoterma), oppure creare un gradiente crescente di temperatura. Il detector o rivelatore è il sistema che rivela le sostanze man mano che escono dalla colonna: FID = ionizzazione di fiamma, le sostanze sono bruciate, gli ioni che si formano forniscono un segnale elettrico; MS = spettrometria di massa, le sostanze sono ‘frantumate’ fornendo uno spettro di massa, caratteristico di ogni singola sostanza.

Profilo GC-FID di un olio essenziale di Origano siciliano Dati: area del picco (%), tempo di ritenzione

Calcolo dell’indice di ritenzione - RI L’indice di ritenzione (RI) è una caratteristica invariante di ogni sostanza, a differenza del tempo di ritenzione. L’indice di ritenzione è relativo a quello di una miscela di n-alcani, analizzata nelle stesse condizioni del composto/i incognito (X). A ciascun n-alcano è assegnato per definizione un indice di ritenzione pari a 100 x il suo numero di atomi di carbonio. Dove tRX, tRC e tRC+1 sono i tempi di ritenzione del composto incognito X, dell’alcano con C atomi di carbonio e dell’alcano con C+1 atomi di carbonio

Gas cromatografia – Spettrometria di Massa GC-MS Interfaccia diretta fra la colonna capillare e l’MS

SPETTROMETRIA DI MASSA Schema di uno spettrometro di massa La spettrometria di massa e' una tecnica che di norma permette di attribuire la formula molecolare ai composti chimici. Sono necessari anche pochi millesimi di milligrammo per ottenere uno spettro di massa da cui risalire alla struttura di un determinato composto. Nella nostra attività, si ha spesso a che fare piuttosto che con composti puri con miscele molto complesse, quali sono un estratto di una pianta officinale o un olio essenziale. In questo caso l'accoppiamento della spettrometria di massa con la gas-cromatografia (GC) o con la cromatografia liquida ad alta efficienza (HPLC) permette di ottenere moltissime informazioni sulla loro composizione. Schema di uno spettrometro di massa

ANALIZZATORE A QUADRUPOLO L’analizzatore quadrupolo è un analizzatore di ioni compatto e, di norma, poco costoso basato sul campo magnetico statico. Il flusso di ioni attraversa uno spazio a sezione quadrata al centro di quattro barre orizzontali parallele alle cui coppie diagonalmente opposte sono applicate correnti continue di segno opposto. Questo campo elettrico fisso, unito ad un altro oscillante con frequenze dell'ordine delle onde radio, fa muovere gli ioni secondo traiettorie sinusoidali consentendo solo a quelli di una data massa di attraversare l'intero quadrupolo e giungere al rivelatore. Schema generale di un HPLC o GC MS a quadrupolo Dettaglio del quadrupolo e suo funzionamento. Solo gli ioni la cui massa ricade nel range selezionato raggiungono il detector.

componente x e gli spettri massa presenti nella banca dati Procedura di “matching” fra lo spettro di massa del componente x e gli spettri massa presenti nella banca dati Linalolo Monoterpene ossigenato Un valore di somiglianza (matching) di oltre l’85 % è un ottimo indizio , che se corroborato anche dall’indice di ritenzione fornisce la definitiva caratterizzazione del componente.

Sesquiterpene idrocarburo b-Cariofillene Sesquiterpene idrocarburo

Profilo GC-MS di un olio essenziale di limone Procedura di “matching”

ATTIVITA’ BIOLOGICHE DEGLI OLI ESSENZIALI antibatterica antivirale antifungina anti-infiammatoria ansiolitica antispastica antiossidante sono gli effetti farmacologici attribuiti agli oli essenziali (confermati da diversi saggi in vitro ed in alcuni in vivo). Altre attività con minori supporti sperimentali sono quelle: analgesica, carminativa, antiemetica, anti-depressiva

SETTORI DI UTILIZZO DEGLI OLI ESSENZIALI Aromi Cura Personale Farmaceutica Industriale Pesticidi Sprays Repellenti Trappole Alimenti & Bevande Aromatizzazione Dolci Conservanti Bevande Medicinali Antimicrobici Decongestionanti Cosmetica & Igiene Profumi, Colonie Sprays Creme, Polveri Saponi, Shampoo Industria dell’auto Lucidanti, Smacchiatori Deodoranti Industria del Tabacco Aromatizzazione Fissativi Veterinaria - Farmaceutici Igiene Orale Dentifrici Collutori Antisettici Cementi Carta & Stampa Pastelli, inchiostri Etichette, imballaggi Gomma & Plastica Deodoranti Gomma e plastica Farmaceutico - Aromatizzazione Prodotti per la casa Saponi & Detergenti Smacchiatori Aromatizzazione ambienti Industria Tessile Deodoranti Tappezzeria Materiali di finitura Colori & Adesivi Cementi e Colle Colori, Abrasivi Smacchaitori Adattato da “Herbs, spices and essential oil: post harvest operations in developing country” di M. Douglas et al., FAO, 2005