Daniela Lippi e Maria Rita De Paolis Consiglio Nazionale delle Ricerche Corso di formazione integrata scientifica e tecnologica (A.S. 2002/03) http://usr-lazio.artov.rm.cnr.it/fiset2002/ Modulo 6: Aspetti chimico-fisici e biologici dell’ambiente "suolo" Daniela Lippi e Maria Rita De Paolis Istituto di Biologia Agroambientale e Forestale Area della Ricerca di Roma1 “Montelibretti” - lippi@ibaf.cnr.it

Calendario degli incontri del modulo 6: Aspetti chimico-fisici e biologici dell’ambiente "suolo” 1. Ecosistema suolo 06/02 Artov 2. Pedogenesi 20/02 Mlib 3. Turnover della sostanza organica nel suolo 27/02 Mlib 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo 06/03 Mlib 1. Ecosistema suolo 06/02 Artov 2. Pedogenesi 20/02 Mlib 3. Turnover della sostanza organica nel suolo 27/02 Mlib 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo 06/03 Mlib 5. Ciclo dell’Azoto 13/03 Mlib 6. Ciclo del Carbonio 20/03 Mlib

Aspetti chimico-fisici e biologici dell’ambiente "suolo" 5. Ciclo dell’Azoto Parte teorica Esperienze di laboratorio  Introduzione  Analisi di attività batteriche  Immobilizzazione  Dosaggio proteine  Mineralizzazione  Azotofissazione  Azotofissazione

Ciclo molto complesso: 5. Ciclo dell’azoto Introduzione La dipendenza reciproca di tutte le forme di vita sulla terra è dimostrata nei cicli biogeochimici dei principali elementi nutritivi; in particolare nei cicli dell'Azoto e del Carbonio nei quali troviamo una componente geochimica e una componente biologica Riserve di azoto 60-70 x 1015 t Litosfera 95-98% Atmosfera 2-5% Ciclo molto complesso:  Composti solidi, liquidi e gassosi Biosfera 0,01%  Solubili e insolubili  N° ossidazione da +5 a -3 Tutti presenti, ma prevale la forma ridotta (-3),  90% in natura e  100% nella biosfera  Passaggi pluridirezionali  Numerosi ingressi e uscite  Attività antropiche  Difficoltà di valutare il bilancio Quindi: NH3 e NH4+

L'azoto è il nutriente più richiesto da tutti gli organismi viventi e diviene spesso il fattore limitante Anche per quanto riguarda la capacità di assumere azoto gli organismi viventi si possono suddividere nelle tre grandi categorie:  organismi fotosintetici (produttori) assimilano azoto solamente sotto forma di ammonio o nitrati  animali assimilano azoto organico come proteine e aminoacidi  microrganismi decompongono e mineralizzano il materiale organico, liberando CO2 e NH3

Rappresentazione schematica del ciclo dell’azoto (-1) NH2OH (+1)N2O (+2) NO N2 (+5) NO3 Biomassa (-3) N (-3) NH3 (+3) NO2 Atmosfera Biosfera Fissazione dell’azoto Nitrificazione Assimilazione riduttiva del nitrato Denitrificazione o dissimulazione riduttiva del nitrato Assimilazione dell’ammonio Ammonificazione

Immobilizzazione Mineralizzazione Immobilizzazione 5. Ciclo dell’azoto Esclusa l'atmosfera, l'azoto è presente quasi esclusivamente in forma ridotta e viene incorporato come ammonio nelle proteine, negli acidi nucleici e negli altri composti organici nelle cellule degli organismi viventi. Anche le riserve di azoto nel suolo sono nella forma ammoniacale:  come sostanza organica (residui vegetali e animali o fertilizzanti)  come forma minerale adsorbita sulle rocce, fillosilicati in grado di legare gli ioni ammonio. Nel suolo esiste un ciclo interno, distinto dal ciclo complessivo, che porta all'interscambio di azoto inorganico (NO3- e NH4+) con quello organico. Mineralizzazione Azoto organico NH4+ NO3- Immobilizzazione

Biomassa Assimilazione riduttiva del nitrato (-3) N (+5) NO3 (-3) NH3 (+3)NO2 (+5)NO3 (-1) NH2OH Le piante assorbono solo ioni nitrato e ammonio La scelta dipende dalla specie vegetale, dalla temperatura e dal pH della soluzione circolante nel terreno perchè:  nitrati (ione-) in soluzione più disponibili  ammonio (ione+) "fissato" sull’argilla meno disponibile La riduzione del nitrato avviene in due stadi ad opera di due enzimi specifici: molibdo-flavo proteina che catalizza il trasferimento di elettroni per la riduzione del nitrato a nitrito nitrato riduttasi ferro-zolfo proteina che riduce il nitrito ad ammonio utilizzando come donatore di elettroni la ferridossina ridotta, generata dalla fotosintesi nitrito riduttasi

Struttura e funzione degli enzimi 1. Gli enzimi (catalizzatori biologici) sono proteine globose, formate da più sub-unità. Presentano uno o più siti attivi dove avviene il legame con il substrato che innesca la reazione. 3 Prodotti di reazione * 1 Substrato Enzima * Siti attivi 2 2. La perfetta complementarietà tra enzima e substrato garantisce la specificità. 3. Al termine l’enzima è inalterato e pronto per catalizzare un'altra reazione.

NADPH2 NO3 - NADP+ NO2 - HNO3 + 2e- + 2H+ HNO2 + H2O La nitrato riduttasi è un complesso enzimatico che ha la funzione di catalizzare il trasferimento di 2 elettroni dal NAD(P)H2 (piridin-nucleotide, donatore di elettroni) al nitrato (+5) che si riduce a nitrito (+3) NO3 - NO2 - NADPH2 NADP+ FAD Citocromo Mo HNO3 + 2e- + 2H+ HNO2 + H2O E’ costituito da due parti non separabili fisicamente:  una contiene il FAD (Flavin adenin dinucleotide) ed ha il sito attivo per il NAD(P)H  una contiene Molibdeno e porta il sito attivo per il nitrato Porta associato anche un citocromo Il FAD, il citocromo e il molibdeno formano una catena di trasporto attraverso la quale gli elettroni sottratti al NAD(P)H arrivano al nitrato che si riduce a nitrito Il molibdeno è un elemento indispensabile per le piante

Biomassa Assimilazione dell’ammonio (-3) N (-3) NH3 (+1) N2O (+2) NO N2 Biomassa (-3) N (-3) NH3 (+3)NO2 (+5)NO3 (-1) NH2OH (-3) NH3 Biomassa (-3) N L’assimilazione avviene attraverso reazioni catalizzate da diversi enzimi:  Aminazione: trasferimento di NH4+ a chetoacidi amminoacidi  Transaminazione: trasferimento del gruppo amminico (NH2-) da un amminoacido a un chetoacido Gli amminoacidi sono molto più numerosi dei 20 costituenti principali delle proteine H R Gli animali ne formano solo 8; nelle piante ne sono stati isolati oltre 50 liberi

Mineralizzazione 5. Ciclo dell’azoto  La mineralizzazione è il processo di degradazione operato dagli organismi decompositori che porta alla formazione di azoto minerale nitrico e ammoniacale, detti “azoto scambiabile”  Nel suolo è in equilibrio con l’immobilizzazione che è la simultanea sintesi di nuova biomassa  L’azoto potenzialmente mineralizzabile è  l'8-15% dell'azoto totale  Il contenuto varia con il tempo, da sito a sito e in funzione della temperatura, del pH, dell'ossigenazione, delle condizioni idriche, della vitalità della biomassa, del tipo di sostanza organica, ecc.  Anche le più comuni pratiche agricole influenzano le trasformazioni dell'azoto organico: lavorazioni del terreno, irrigazione, fertilizzazione, tipo di coltura  Processo molto lento: 1) le proteine formano complessi con i costituenti poco degradabili dell'humus, per esempio la lignina e formano ligno-proteine, 2) le proteine vengono intrappolate e trattenute nell'argilla  Difficile e complesso valutare il potere di mineralizzazione di un suolo

Biomassa Ammonificazione - Prima fase della mineralizzazione (-3) N (+1) N2O (+2) NO N2 Biomassa (-3) N (-3) NH3 (+3)NO2 (+5)NO3 (-1) NH2OH (-3) NH3 Biomassa (-3) N Microrganismi eterotrofi decompositori: batteri, funghi, attinomiceti (105-107/g) In serie, per mezzo di enzimi extracellulari, arrivano a liberare NH3 con due processi Ammonificazione: proteolisi aerobica di proteine e acidi nucleici con formazione di amminoacidi e basi Putrefazione: decomposizione anaerobica delle proteine con formazione di ammine e altri composti organici volatili

Nitrificazione (-1) NH2OH (-3) NH3 (+3)NO2- (+5)NO3- (+1) N2O (+2) NO N2 Biomassa (-3) N (-3) NH3 (+3)NO2 (+5)NO3 (-1) NH2OH Ossidazione dell’ammonio a ione nitrico in due fasi per opera di batteri aerobi chemiolitotrofi obbligati NH4+ NO2- NO2- NO3- Le reazioni liberano notevoli quantità di energia, utilizzata per le biosintesi cellulari Nitrosomonas Nitrobacter Nitrosococcus Nitrococcus Nitrosospira Nitrospira

Denitrificazione o dissimulazione riduttiva del nitrato (+1) N2O (+2) NO (+5) NO3 (+3) NO2 N2 (+1) N2O (+2) NO N2 Biomassa (-3) N (-3) NH3 (+3)NO2 (+5)NO3 (-1) NH2OH L’azoto nitrico viene ridotto ed allontanato in forma gassosa con diversi meccanismi La via microbiologica è la più importante: produce N2 e N2O  volatilizzazione diretta dell’ammoniaca pH  7 Tre meccanismi chimici dipendono dal pH  decomposizione spontanea dei nitriti con emissione di ossidi di azoto pH  5,5  reazioni spontanee di acido nitroso con amminoacidi o sali di ammonio ed emissione di N2

 La denitrificazione microbiologica è, idealmente, l’inverso della nitrificazione  Avviene nel suolo e nelle acque in ambiente riducente, cioè privo di ossigeno che è il fattore principale di controllo di questo processo  Anche in suoli dotati di buona aerazione si possono trovare, all’interno degli aggregati, micrositi ad alta attività denitrificante  E’ una respirazione anaerobica che utilizza il nitrato come accettore di elettroni  Soltanto alcuni batteri chemioeterotrofi anaerobi facoltativi, Pseudomonas e Bacillus, sono capaci di compiere questo tipo di respirazione che ha come risultato l’emissione e non l’assimilazione di N2  La reazione globale, catalizzata dalla nitrato riduttasi, è 2 HNO3 + 10 H+ + 10 e- N2 + 6 H2O il trasporto degli elettroni avviene attraverso la catena dei citocromi Pseudomonas fluorescens Bacillus cereus

Fissazione industriale Azotofissazione 5. Ciclo dell’azoto La fissazione biologica è il processo più importante attraverso il quale l'azoto molecolare inorganico viene ridotto e fissato in una forma molecolare organica Per questa via viene inserito nel processo di mineralizzazione-immobilizzazione e messo a disposizione degli organismi produttori e di conseguenza di tutti gli altri Fissazione industriale (processo Haber-Bosch) Fissazione biologica Necessita anch’essa di molta energia e di un catalizzatore N2 + 3 H2 2NH3 * Alta temperatura (300-600°C) * Temperatura ( 30°C) * Alta pressione (200-800 atm) * Pressione normale * Catalizzatore: miscela Fe-Mo * Nitrogenasi: Mo-Fe proteina * Resa 20-40% di NH3 * Varia con condizioni ambientali * Produzione  70 milioni di t annue * Produzione  200 milioni di t annue * Alto inquinamento ( 50% perso) * Arricchimento naturale del suolo * Alti costi * Pronta disponibilità

Liberi o Simbionti Aerobi Anaerobi Batteri Cianoficee I microrganismi capaci di fissare l'azoto atmosferico sono detti azotofissatori o diazotrofi. Appartengono ad alcune famiglie di batteri e di Cianoficee (alghe verdi-azzurre). Possono essere Rizosfera Tubercoli radicali Liberi o Simbionti Attività bassa Attività alta Aerobi Anaerobi Batteri Cianoficee Azotobacter Beijerinckia Derxia Spirillum Enterobacter Klebsiella Clostridium Desulfovibrio Chlorobium Rhizobium Actinomyces Frankia Nostoc Anabaena

Nitrogenasi e suo meccanismo di azione La nitrogenasi, enzima responsabile dell’ azotofissazione biologica, è un complesso enzimatico costituito da due proteine distinte, indispensabili: la dinitrogenasi riduttasi, una ferro-proteina formata da due subunità identiche contenenti 4 atomi di Fe e 4 di S la dinitrogenasi, una molibdo-ferro-proteina formata da 4 subunità contenenti 2 atomi di molibdeno, 21-35 atomi di Fe e 18-24 gruppi SH Fe-proteina Mo-Fe-proteina N2 2NH3 Mg-ADP+Pi Mg-ATP NADH NAD+ Ferridossina ossidata ridotta e- Una serie di reazioni riduce l'azoto ad ammoniaca attraverso trasferimenti di elettroni. Il primo trasferimento alla Fe-proteina avviene con un flusso casuale mentre in seguito essa li trasferisce singolarmente alla Mo-Fe-proteina. Ciò deve essere ripetuto più volte affinché la Mo-Fe-proteina sia in uno stato sufficientemente ridotto, da consentirle di ridurre l’ N2

Proprietà della nitrogenasi Nel 1966 si è scoperto che la nitrogenasi agisce anche riducendo l’acetilene ad etilene, rompendo uno dei tre legami tra gli atomi di Carbonio. HC  CH  H2C  CH2 (1) N  N  HN  NH (2) Basandosi sul dosaggio gascromatografico della riduzione dell’acetilene (reazione 1) è stato possibile caratterizzare la nitrogenasi e valutare la quantità di azoto fissato (reazione 2) Le due proteine componenti della nitrogenasi vengono inattivate dall’ossigeno Gli azotofissatori aerobi attuano diversi meccanismi fisiologici per proteggere la nitrogenasi dal danno da ossigeno:  Controllo genetico  Microaerofilia  Protezione respiratoria La capacità di ridurre l’azoto è molto più diffusa tra i microrganismi anaerobi  Protezione conformazionale  Barriere fisiche  Proteine specifiche

Neoformazioni radicali: Azotofissazione simbiotica L’azotofissazione (batteri) è accoppiata direttamente alla fotosintesi (piante) La più nota è la simbiosi tra Rizobi e Leguminose Circa 600 generi e 18.000 specie, includono piante arboree, arbustive, erbacee ed anche acquatiche. Un buon prato di trifoglio arriva a fissare 100-400 Kg di azoto per ettaro. Batteri Gram-negativi, aerobi, mobili, di forma bastoncellare, possono anche vivere come eterotrofi nel suolo: 102-104 per g Neoformazioni radicali: Noduli Certe Acacie tropicali possono fissare fino a 200 Kg/ha/anno Simbiosi specifica Rizobi compatibili Efficienza

Ciclo dei rizobi nel suolo 1) adesione dei rizobi ai peli radicali a seguito di segnali molecolari tra pianta e ospite: induzione geni nod Bastoncini mobili Batteroidi Cocchi immobili (1) (5) 2) incurvamento dei peli radicali 3) inizio e sviluppo del filo di infezione (8) Rhizobium Pelo radicale Formazione del tubo d’infezione Noduli Infezione del pelo radicale 4) rilascio e moltiplicazione dei batteri, avvolti dalla membrana, all'interno delle cellule corticali dell'ospite 1 5) trasformazione dei batteri in batteroidi, 10 volte più grandi, che non si dividono 2 6) sintesi della leg-emoglobina nel citoplasma della cellula vegetale 3 7) sintesi della nitrogenasi (geni nif) e fissazione dell'azoto 7-8 8) degenerazione del nodulo e liberazione dei rizobi nel terreno dove riprendono la forma di cocchi 4 5-6 Processo di infezione e formazione dei noduli

1° - Flusso di ammonio tra suolo e piante Scomposizione del ciclo dell’azoto Si può immaginare di scomporre il ciclo dell’azoto in tre sottocicli che si svolgono in ambiti sempre più ampi N organico NH4+ riserve soluzione N organico 1 2 3 1° - Flusso di ammonio tra suolo e piante 1. Scambi di ammonio, nel suolo, tra riserve e soluzione circolante 2. Assimilazione degli ioni ammonio da parte dei vegetali 3. Restituzione al suolo dei residui vegetali

2° - Processi ossidoriduttivi tra suolo e organismi viventi organico NH4+ riserve soluzione N organico NO3- 1 3 4 2 1. Assimilazione dei nitrati 2. Deposizione al suolo dei residui vegetali 3. “Ammonificazione” = degradazione dei residui vegetali 4. Nitrificazione

3° - Processi ossidoriduttivi tra suolo e atmosfera N organico NH4+ riserve NO3- 3 4 1 2 soluzione N2 1. Azotofissazione 2. Denitrificazione (3. Nitrificazione)

Analisi di attività batteriche 5. Ciclo dell’azoto Analisi di attività batteriche  Dosaggio di proteine in una coltura batterica Lowry et al. (1951)  Preparazione del materiale Soluzioni NaOH 1 N NaOH 0,1 N Na2CO3 2% in NaOH 0,1 N CuSO4•5H2O 1% in H2O distillata Tartrato di sodio 2% in H2O distillata o potassio Assorbanza g/ml proteine Prima di procedere al dosaggio delle proteine in una coltura batterica è necessario disegnare su carta millimetrata la curva di taratura utilizzando una soluzione a concentrazione nota di Albumina

 Idrolizzare i campioni nel modo seguente:  centrifugare per 20 minuti a 10000 giri/min 3 ml di coltura batterica  risospendere il pellet in 3 ml di soluzione NaOH 1N  prelevare (in doppio) 1 ml della sospensione ottenuta e metterlo in una provetta di vetro; chiudere ciascuna provetta con carta d’alluminio  mettere le provette a bollire per 10 minuti

 Proseguire con il metodo di Lowry per la determinazione delle proteine:  preparare la miscela di reazione nella quantità necessaria, mescolando con le seguenti proporzioni le soluzioni: Na2CO3 10 ml CuSO4 5 H2O 0,1 ml Tartrato di sodio o potassio 0,1 ml  prelevare dalle provette del campione bollito 0,8 ml e metterli in un’altra provetta  aggiungere 4 ml della miscela di reazione  lasciare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti  aggiungere 0,4 ml di reagente Folin e mettere le provette al buio per 30 minuti

 leggere l’assorbanza allo spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 500 nm g/ml proteine  valutare la quantità di proteine dei campioni dalla curva di taratura N.B. La lettura del campione allo spettrofotometro deve essere fatta contro un bianco (H2O) sottoposto alle stesse reazioni del campione

 Azotofissazione: saggio della riduzione dell’acetilene Gascromatografia o cromatografia in fase gassosa Tecnica di separazione di miscele Fase stazionaria Fase mobile Solido granulare poroso riempie la colonna Gas fluisce attraverso la colonna I meccanismi di separazione sono due: adsorbimento esclusione molecolare Dipende dalla diversa forza dei legami con cui le molecole del campione sono trattenute sulla superficie delle particelle solide che riempiono la colonna Fase stazionaria costituita da solido granulare poroso che trattiene le molecole aventi ingombro inferiore al diametro dei pori ed escludendo le altre che vengono eluite con il gas di trasporto