Analisi microbiologica dei campioni 4. Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo Analisi microbiologica dei campioni  Metodi di rilevamento Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere determinato: 1 ml Sospensione di terreno 1 2 3 4 5 6 7 8 10-1 10-2 10-8 10-6 10-3 10-4 10-5 10-7 Tecnica del vetrino interrato Se la superficie del vetrino è pulita, non è selettiva, e agisce come le particelle minerali del suolo Metodo delle diluizioni di sospensioni di suolo Conte dirette al microscopio ottico o all’epifluorescenza o elettronico a scansione Valori in difetto Valori in eccesso

Conte dirette Colorazioni vitali Il numero dei batteri calcolato con metodi colturali è di circa 106-108 batteri per grammo di terra secca, mentre quello ottenuto per microscopia diretta è di circa 10-100 volte superiore. Conte dirette I valori sono approssimati per eccesso in quanto vengono calcolate anche le cellule morte Colorazioni vitali Permettono di distinguere le cellule ancora in grado di respirare da quelle che non metabolizzano più.

Hemolysis

Subito dopo l’inoculo si depongono sulla superficie della piastra una serie di dischetti di carta assorbente sterili imbevuti di adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare.  Si divide la piastra in spicchi, uno per ciascun antibiotico, e si deposita al centro di ogni spicchio il dischetto corrispondente, con l’aiuto di una pinzetta sterile. Si pongono le piastre in incubatore a 37°C per 18-24 ore. Si misura il diametro degli aloni di inibizione per ogni antibiotico.

Sospensione e serie delle diluizioni 1) Preparazione del materiale a) Preparare 500 ml di soluzione fisiologica (NaCl 9‰ in H2O deionizzata). Distribuire come al punto b e versare il rimanente in una beuta da 1000 ml, sterilizzare b) Preparare una beuta da 250 ml con 95 ml di soluzione fisiologica, alla quale si aggiungano circa 100 palline di vetro, sterilizzare c) Sterilizzare alcune provette vuote da 22mm per le diluizioni

2) Sospensione del campione e diluizioni seriali a) Prelevare 5 grammi dal campione mediato e metterli nella beuta sterile contenente la soluzione fisiologica e le palline di vetro. In questo modo si ottiene la diluizione 10-1 b) Mettere la beuta ad agitare per 15 minuti c) Distribuire sterilmente 9 ml di soluzione fisiologica in 5 provette sterili 9 ml d) Fare le diluizioni: prelevare 1 ml di soluzione dalla beuta di partenza (diluizione10-1) e metterlo in una provetta contenente 9 ml di soluzione fisiologica; procedere in successione fino ad ottenere la diluizione 10-6 1 ml 9 ml Diluizioni seriali

3) Conta su piastra a) Per i funghi, dalle diluizioni 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 prelevare sterilmente 0,1 ml, versarlo sulla piastra e spargere la coltura con un'ansa sterile b) Per i batteri, procedere allo stesso modo ma considerare le diluizioni 10-3, 10-4, 10-5; 10-6 c) Inoculare 3 piastre per ciascuna diluizione, sia per la conta dei funghi che per la conta dei batteri Aggiungere una o due piastre di controllo per ciascun terreno, inoculate con soluzione fisiologica sterile N.B. Ricordarsi di indicare su ciascuna piastra il tipo di terreno utilizzato specifico per batteri o funghi, il campione, la diluizione e la data. d) Incubare a 28°C per circa una settimana; procedere con la conta delle colonie cresciute sulle piastre inoculate e registrare i dati raccolti per la successiva elaborazione

Analisi di attività batteriche 5. Ciclo dell’azoto Analisi di attività batteriche  Dosaggio di proteine in una coltura batterica Lowry et al. (1951)  Preparazione del materiale Soluzioni NaOH 1 N NaOH 0,1 N Na2CO3 2% in NaOH 0,1 N CuSO4•5H2O 1% in H2O distillata Tartrato di sodio 2% in H2O distillata o potassio Assorbanza g/ml proteine Prima di procedere al dosaggio delle proteine in una coltura batterica è necessario disegnare su carta millimetrata la curva di taratura utilizzando una soluzione a concentrazione nota di Albumina

 Idrolizzare i campioni nel modo seguente:  centrifugare per 20 minuti a 10000 giri/min 3 ml di coltura batterica  risospendere il pellet in 3 ml di soluzione NaOH 1N  prelevare (in doppio) 1 ml della sospensione ottenuta e metterlo in una provetta di vetro; chiudere ciascuna provetta con carta d’alluminio  mettere le provette a bollire per 10 minuti

 Proseguire con il metodo di Lowry per la determinazione delle proteine:  preparare la miscela di reazione nella quantità necessaria, mescolando con le seguenti proporzioni le soluzioni: Na2CO3 10 ml CuSO4 5 H2O 0,1 ml Tartrato di sodio o potassio 0,1 ml  prelevare dalle provette del campione bollito 0,8 ml e metterli in un’altra provetta  aggiungere 4 ml della miscela di reazione  lasciare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti  aggiungere 0,4 ml di reagente Folin e mettere le provette al buio per 30 minuti

 leggere l’assorbanza allo spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 500 nm g/ml proteine  valutare la quantità di proteine dei campioni dalla curva di taratura N.B. La lettura del campione allo spettrofotometro deve essere fatta contro un bianco (H2O) sottoposto alle stesse reazioni del campione

Controllo dello sviluppo microbico Per controllo dello sviluppo microbico si possono intendere diverse cose: si può volere inibire e non uccidere i microrganismi, oppure si vuole eliminare totalmente la popolazione microbica su soggetti inanimati o su superfici viventi. Si usano diversi metodi e diverse terminologie ne indicano le finalità.

Controllo dello sviluppo microbico Sterilizzazione: è il processo in cui vengono distrutte o rimosse tutte le cellule viventi (includendo le spore, i virus e i viroidi) da un determinato habitat o da oggetti inanimati; Disinfezione: uccisione o inibizione di soli microrganismi patogeni e disinfettanti sono gli agenti chimici che vengono usati nei processi di disinfezione; Sanificazione: la carica microbica viene ridotta entro limiti considerati sicuri per gli standard di sanità pubblica;

Controllo dello sviluppo microbico Antisepsi: è la pratica in grado di prevenire una infezione e si dicono antisettici i composti chimici utilizzati; Antibiotici e chemioterapici: rientrano nelle categorie dei composti in grado di controllare lo sviluppo microbico.

Il modello di morte microbica La distruzione di una popolazione microbica non avviene istantaneamente con l’esposizione ad un agente letale. Dopo che la popolazione ha subito una marcata riduzione, il tasso di mortalità rallenta e ciò consente la sopravvivenza di ceppi microbici più resistenti. E’ molto difficile stabilire il punto di morte dei microrganismi: quando avviene? Generalmente quando una cellula, inoculata in brodo fresco, non dà più origine ad una progenie.

Figure: 20-03a Caption: Use of the autoclave for sterilization. (a) The flow of steam through an autoclave.

Figure: 20-03b Caption: Use of the autoclave for sterilization. (b) A typical autoclave cycle. Shown is the sterilization of a fairly bulky object. The temperature of the object rises more slowly than the temperature of the autoclave.

Figure: 20-03c Caption: Use of the autoclave for sterilization. (c) A modern research autoclave. Note the pressure-lock door and the automatic cycle controls on the right panel. The steam inlet and exhaust fittings are on the right side of the autoclave.

Figure: 20-04 Caption: A biological safety cabinet, shown with an ultraviolet (UV) radiation source (mercury vapor lamp), which is used for decontamination of the inside surfaces.

Figure: 20-07 Caption: Scanning electron micrograph of aquatic bacteria and algae trapped on a Nucleopore filter. The pore size is 5 µm.

Figure: 20-08a-01 Caption: Membrane filters. (a) Assembly of a reusable membrane filter apparatus.

Figure: 20-08a-02 Caption: Membrane filters. (a) Assembly of a reusable membrane filter apparatus.

….by manu!!!

MICROBIOLOGIA AMBIENTALE PANORAMA sulle TECNICHE “CLASSICHE E MOLECOLARI”

Diversità morfologica dei microrganismi MORFOLOGIA CELLULARE OSSERVABILE AL MICROSCOPIO

Diversità morfologica dei microrganismi Numero e disposizione dei flagelli in rapporto alla cellula Monotrico Anfitrico Flagello/i: non visibile al microscopio!!! Lofotrico Peritrico MORFOLOGIA CELLULARE

Microscopia ottica ed elettronica MICROSCOPIA = insieme delle tecniche legate all’osservazione di organismi microscopici

Microscopia ottica ed elettronica

Microscopia ottica ed elettronica Fonte luminosa Campione Obiettivo Oculare Fascio di elettroni Lente magnetica Lente obiettivo Lente proiettore Immagine schermo fluorescente Microscopia ottica Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

Microscopia ottica ed elettronica Concetti chiave Ingrandimento. 2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti. - occhio umano 75-100 m; - microscopio ottico: 0.2 m (200 nm); - microscopio elettronico: 0.2-2 nm. Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (luce-fascio di elettroni).

Schema: microscopio composto OCULARE- GENERALMENTE BINOCULARE !! Tubo metallico Ruota obiettivi Braccio OBIETTIVO 10X OBIETTIVO 40X OBIETTIVO 100X Tavolino Porta campione Vite macrometrica Vite micrometrica MESSA A FUOCO Ganci Condensatore Diaframma Sorgente di luce Base microscopio

Principi di base: microscopio composto Sistema di lenti convergenti: Oculare ed 2. Obiettivo all’estremità di un tubo metallico (160 mm) Campione (oggetto) davanti l’ obiettivo → immagine reale-capovolta ed ingrandita - Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti all’oculare →immagine virtuale, capovolta ed ingrandita

Principi di base: microscopio composto 10X oculare 10X, 40X,100X obiettivi INGRANDIMENTO FISSO Ingrandimento totale= Ingr. oculare X Ingr. obiettivo OBIETTIVO ED OCULARE LAVORANO INSIEME PER RISOLVERE L’IMMAGINE L’oculare “risolve” l’immagine “reale” risolta dall’obbiettivo

Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione L’obiettivo 100X è sempre ad immersione; L’obiettivo 100X è retrattatile; L’olio ha lo stesso indice di rifrazione del vetro dell’obiettivo .

Osservazione in vivo e le colorazioni - vetrino + goccia campione+ coprioggetto; - vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto; - vetrino + goccia campione+ coprioggetto. 2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità per specifiche componenti cellulari. Distinguiamo : A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e polisaccaridi acidi, COO-] : blu di metilene, safranina e cristal violetto. B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture cellulari citoplasmatiche]. Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.

Biologia molecolare (?) Esami in laboratorio Esami colturali Colorazione di Gram Biologia molecolare (?)

Colorazione di Gram Fasi della colorazione Struttura della parete Gram-positivi Gram-negativi

Esame colturale per batteri Gram-negativi agar McConkey (Enterobatteri) agar sangue (G. vaginalis) agar cioccolato (Gonococco) Gram-positivi agar sale mannite (Stafilococchi) agar sangue (Streptococchi )

Colorazione di Gram 1884 Hans Christian Gram Tecnica basata sulle proprietà fisiche della pareta cellulare

Identificazione microbica Batteri Gram-negativi Indolo e/o Mobilità in SIM agar Prove biochimiche: TSI agar Gallerie API 20 E Gallerie API 20 NE Gallerie API NH

Identificazione microbica Staphylococcus aureus Mannite+ e Coagulasi+ Test coagulasi Test catalasi Gallerie API Staph (bioMérieux)

Lieviti: esame colturale Sabouraud dextrosio agar (Incubazione a 37° per 2-5 gg)

Colorazione di Gram Asciugare all’aria Fissare alla fiamma RISULTATO AL MICROSCOPIO?

Colorazione di Gram Quali sono Gram positivi e quali Gram negativi?

Colorazione di Gram

…“ma…” La colorazione di GRAM è molto utilizzata in microbiologia clinica, ma poco sfruttabile in microbiologia ambientale

Microscopia ad epifluorescenza SYBR-GREEN Labels double DNA strain DAPI A simple-to-use fluorescent stain, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), visualizes nuclear DNA in both living and fixed cells Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp. 1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast. Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1. and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture at time zero. Upper panel magnification was 10006 × , lower panel magnification was 23006 ×.

COLTURE DI MICRORGANISMI La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto. Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.

Colture di microrganismi RIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHE DELL’AMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENERE DELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI IN LABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE, L’ATTIVITà ANCHE AL FINE PER APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE.

MEZZI (TERRENI) DI COLTURA solido liquido

TERRENI DI COLTURA Terreni sintetici o definiti : COMPOSIZIONE ESATTA Terreni complessi : COMPOSIZIONE non nota, generalmente contengono Peptoni, idrosilati di carne, caseina etc… Estratti di carne: contenenti amminoacidi, proteini, peptidi, nucleotidim vitamine Estratti di lievito, ricchi di vitamine della famiglia B, essenziali per il metabolismo cellulare. Terreni selettivi Terreni differenziali Terreni di arricchimento

MEZZI (TERRENI) DI COLTURA The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow.  The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content. Streptococcus agalactiae does not grow on MSA because of the high salt content. Staphylococcus epidermidis grows but does not ferment mannitol. Esempio di Terreno selettivo: MANNITOL SALT AGAR Selettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;

TERRENO DI COLTURA: differenziale Sodium Chloride 5.0gm Sodium Acetate 2.0gm Monoammonium Phosphate 1.0gm Dipotassium Phosphate Magnesium Sulfate 0.1gm Bromothymol Blue 0.08gm Agar 20.0gm Final pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C. Shigella flexneri Inibito dall’ acetato. Assenza di crescita Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi . 24h a 35 °C Escherichia coli Formazione di colonie su Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi. 24 h at 35°C

Diversità morfologica dei microrganismi DIVERSITA MORFOLOGICA DELLE COLONIE IMPORTANZA DEI PIGMENTI E DEI MARGINI DELLE COLONIE

PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE

Test biochimici identificativi DIVERSITà METABOLICA DALLA COLONIA Test biochimici identificativi

DIVERSITà METABOLICA

LA COLONNA DI WINOGRADSKY

Dettaglio batteri sulfurei rossi e verdi, lungo un gradiente di luce SCHEMA di una colonna Dettaglio batteri sulfurei rossi e verdi, lungo un gradiente di luce

PAROLA CHIAVE: GRADIENTE - DI OSSIGENO DI LUCE DI NUTRIENTI (per es ZOLFO)

CONTA DEI MICRORGANISMI A demonstration of a decimal series of dilutions. The 100 sample is a concentrated solution of methylene blue. A 0.2 ml portion of this was added to 1.8 ml (1:9 ratio) of 0.85% saline to create the 1:10 dilution. After mixing, 0.2 ml of the 10-1 dilution was added to a second tube containing 1.8 ml to create the 10-2 dilution. This was continued to generate the dilution series. (B) A series of pour plates demonstrating the appearance of a viable plate count. The 3 plates show a 10-7, 10-8, and 10-9 dilution of a natural sample. Note how the number of colony forming units decreases 10 fold between the plates.

CONTA DEI MICRORGANISMI DAPI, syber green, arancio di acridini Sono colaranti utilizzati anche nella conta di microganismi mediante Microscopia a fluorescenza

MISURA DELL’ATTIVITà DEI MICROORGANISMI RESPIRAZIONE Soil is incubated at the required temperature, moisture content, etc. in the main flask and air can be added through the CO2 absorber in the tube on top of the main flask. During incubation the CO2 produced by respiration is absorbed into the alkali in the side tube. This is then titrated to discover the amount of alkali neutralized by the evolved CO2 More air can be added and the alkali replaced to continue the process of analysis.

MISURA DELL’ATTIVITà DI MICROOGANISMI SPECIFICI AMMONIO E NITRITO OSSIDANTI

METANO-OSSIDANTI = METANOTROFI E METILOTROFI Ricavano energia dall’ossidazione del metano e di altri composti inorganici del carbonio CH4 + 2 O2 -----> CO2 + 2 H2O + energy enzima chiave metano-ossigenasi

16S RNA RIBOSOMIALE Struttura primaria e secondaria dell’ rRNA 16S di E.coli

PANOROMA TECNICHE PER LO STUDIO DELLE COMUNITà MICROBICHE CFU_ colony-forming unit Unità formante colonia Biolog_example of commercial kit PLFA: phospholipids fatty acid profile FISH: Fuorescent in situ Hybridization technique IS-PCR Intergenic Spacer- Polymerase Chain reaction

PLFA: phospholipids fatty acid profile PLFA analysis is based on the extraction of "signature" lipid biomarkers from the cell membranes and walls of microorganisms. Organic solvents are used to extract the lipids from cells, then the lipids are concentrated and analyzed by GC/MS to identify individual lipids. Certain bacterial groups make "signature" fatty acids, so a profile of the PLFA in a sample can be used to characterize the microbial community according to which fatty acids are found and in what concentrations. Below is an example of the PLFA chromatogram from a typical soil sample and the signature fatty acids that indicate the presence of particular broad groups of organisms

REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR) reazione di polimerizzazione a catena Esempi di utilità della PCR : Fornisce una riposta sulla presenza-assenza di un determinato gene, specie, genere,,etcc (microbiologia clinica) Aumenta la disponibilità di materiale genetico da studiare ( mare = ambiente oligotrofico)

REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR) COMPONENTI TEMPERATURA

REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)

ELETTROFORESI AGAROSIO PERCENTUALE dipendente dalla lunghezza del frammento da caricare EBOLLIZIONE (microonde) PREPARAZIONE Cassetta “versamento”del gel nella cassetta

ELETTROFORESI CARICAMENTO CAMPIONI (aggiunta di Loading Buffer) CORSA TRA ELETTRODI

Risultati PCR su gel 1 2 3 4 5 6 7

NUOVE TECNICHE: CITOMETRIA DI FLUSSO

NUOVE TECNICHE: molecolari

Microscopio ad epifluorescenza

Microscopio ad epifluorescenza Schema sorgente di luce 1. Globo di quarzo 2. e 3. Catodo e Anodo 4. Camera di combustione (contenente Hg) 5. Arco voltaico 365 nm 404 434 546 577 613 “linee del mercurio”

“le colorazioni in” Ecologia microbica colorazione fluorescente: DAPI attraversa la membrana cellulare lunghezza d’onda 358 nm visualizzazione cellule vive o fissate microscopia a fluorescenza [4',6-diamidino-2-phenylindole ] Campione DAPI + Microscopio a fluorescenza

Microscopio ad epifluorescenza: immagini SYBR-GREEN DAPI

Microscopio ad epifluorescenza e FISH (Fluorescence in situ Hybridization)

Microscopio ad epifluorescenza e FISH

MICROSCOPIO CONFOCALE

MICROSCOPIO CONFOCALE Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione. Intensità luminosa Segnale elettrico Digitalizzazione 1 punto = 1 pixel Coerenza-Alta intensità-Unica λ Specchio dicroico

MICROSCOPIO CONFOCALE Spostamento verticale della sezione ottica Sovrapposizione singoli piani Ricostruzione 3D

Microbiologia : analisi delle acque Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori di inquinamento

Microbiologia : analisi delle acque Parametri chimici, fisici e microbiologici (batteriologici) Tra i microganismi (batteri e protisti, es. Giardia intestinalis) - Dai risultati delle analisi → Punteggio → Livelli di inquinamento Parametro Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello 5 100- OD( % sat) >10 <20 <30 <50 >50 BOD5 (O2 mg/L) < 2.5 <4 <8 <15 >15 COD (O2 mg/L) <5 <10 <25 >25 NH4 (N mg/L) <0.03 <0.10 <0.50 <1.5 >1.5 NO3 (N mg/L) <0.3 <5.0 <10.0 > 10 P (mg/L) <0.07 <0.15 <0.6 >0.6 Escherichia coli (UFC/100 ml) <100 >1.000 < 5.000 <20.000 > 20.000 Punteggio 80 40 20 10 5

Microbiologia : analisi delle acque Conta dei coliformi totali (UFC/ml) Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml) Conta delgi Streptococchi fecali   TERRENO DI COLTURA T° INC. TEMPO INC. CONTA BATTERICA TOTALE PCA (Plate Agar Count) 22°C 36°C 72h 48h COLIFORMI TOTALI Membrane endo agar less 36°C 24h COLIFORMI FECALI Membrane faecal coliform 44°C STREPTOCOCCHI FECALI KF streptococcus 48h

Microbiologia : Coliformi total. Chi sono e come si “cercano” “Coliforme”: simile ad Escerichia coli, fam. Enterobacteriaceae. Aerobi o anaerobi facoltativi, G-, non sporigeni, lattosio-fermentanti “Organismi indicatori" e in genere non sono patogeni Generi : Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter spp. Colore rosso scuro, nel caso di riflesso metallico verdastro Escherichia coli….

Microbiologia : Coliformi fecali Sinonimo di Coliformi termoresistenti Fermentano il lattosio a 44.5-45 °C

Microbiologia : Streptococchi fecali - Gram positivi Indicatori di inquinamento non recente (vita media>) Terreno KF Sodio azide (inibitore di altri microrganismi) Colonie rosse con alone chiaro attorno

Microbiologia : Streptococchi fecali Chi sono e come si “cercano” Species Colonia rossa Alone giallo Enterococcus faecalis + Enterococcus hirae + (poor) Enterococcus equinus Streptococcus pyogenes - Streptococcus agalactiae Lactobacillus plantarum Escherichia coli Enterobacter cloacae Pseudomonas aeruginosa

Microbiologia : metodo delle membrane filtranti N Colonie /100 ml = N (colonie contate) / volume (campione filtrato) X100