Some paradigmatic examples

Typical 1 H NMR Spectrum Absorbance

Valore medio: 2 MUSD/anno

K1 T2 L3 T4 L5 E6 A7 A8 L9 R10 N11 A12 W13 L14 R 15 E16 V17 G18 L19 K MHz 1 H NMR

Ubiquitin 76 amino acids, 8,5 kDa

1D experiment Could be nice but.....Too crowded.. What do we learn? Chemical shifts relaxation rates Not enough to get a structure

Occorrono informazioni strutturali, e correlazioni tra i vari spin che permettano lassegnamento. Per ottenere cio é necessario osservare tutti i possibili accoppiamenti scalari e dipolari.

NMR MULTIDIMENSIONALE Gli spettri NMR monodimensionali permettono questo solo per molecole semplici e di basso peso molecolare. Allaumentare del PM, diventa impossibile individuare tutti gli accoppiamenti scalari dallanalisi dei multipletti e tutti gli accoppiamenti dipolari dagli esperimenti NOE monodimensinoali.

The need for multidimensional NMR

COSA SIGNIFICA Spettro NMR BIDIMENSIONALE

Cosa è un esperimento bidimensionale ? Dopo un impulso a 90° il segnale è pronto per essere acquisito Facciamo lacquisizione ma NON terminiamo lesperimento ed applichiamo ancora uno o piu impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta, Registrando il segnale NMR che rimane sul piano xy dopo la perturbazione

PREPARAZIONE-ACQUISIZIONE t1- PERTURBAZIONE- ACQUISIZIONE (t2) 90° Aq F1 HAHA A (F1) HBHB Aq F2 A (F1) B (F2) HAHA A (F1) A (F2)

Perché la magnetizzazione di uno spin dovrebbe trasferirsi su quella di un altro spin? Perché ci sono gli accoppiamenti scalari e gli accoppiamenti dipolari

Eccito (impulso a 90°)-Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se la perturbazione non ha effetto e se non cè trasferimento di alcun tipo, Ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2) Dopo la trasformate di Fourier io otterro uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata

Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1. Il risultato è che avro dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà linformazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema M ( I t 1 ) ( S t 2 ) Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)

EXAMPLE N H H C C O We make a 1H experiment and we acquire. Then all signals transfer the information because of scalar coupling N H H C Then I observe Hc I observe Hn I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling

EXAMPLE N H H C C O N H H C Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling 4 ppm9 ppm Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc

EXAMPLE N H H C C O N H H C Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling 4 ppm9 ppm Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc Hn Hc J-coupling

EXAMPLE N H H C C O Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling Hc Hn J-coupling If you begin from Hc, the situation is the same !

EXAMPLE N H H C C O Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling Hc Hn J-coupling Therefore, if I consider only this system Hn Hc J-coupling

The first dimension = t 1 The second dimension = t 2 the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1t1 t2t2 t 1 dimension Or F1 t 2 dimension Or F2

Usually t 1 is also defined as indirect dimension t 2 is also defined as direct dimension the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1t1 t2t2 t 1 dimension Or F1 t 2 dimension Or F2

F1 F2 Definitions Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions Diagonal peak The same frequency is observed in both dimensions CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies

Accoppiamento scalare Laccoppiamento scalare puo comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY

Example: COSY Through-bond connectivities COSY= COrrelation SpectroscopY H4-H5

Example: COSY Through-bond connectivities COSY= COrrelation SpectroscopY H4-H

Beyond COSY COSY is not the only 2D experiment It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms The most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-coupling Is THROUGH SPACE COUPLING

Accoppiamento dipolare Laccoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia Lentità delleffetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, laccoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti Laccoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin allaltro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Perturbo A Aumenta la intensità di B

Accoppiamento dipolare Laccoppiamento dipolare è indipendente dallaccoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici Pensate a degli esempi, per favore Leffetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale, detto NOESY (in realtà si puo anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero non parleremo

Through space AND throuhg bonds Through space Through bond

Quando lo spettro è troppo affollato di segnali, non è possibile fare esperimenti monodimensionali, perché non tutti i segnali sono disttinguibili dagli altri E quindi necessario u nesperimento bidimensionale, ovvero un esperimento che permette di trasferire la magnetizzazinoe da uno spin allaltro utilizzando laccoppiamento dipolare

Example: Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY NOESY NOE Effect: If two spins that are close in space are excited out of equilibrium, they will mutually transfer their magnetization AA AB

Example: Cross peaks: A and B are close Diagonal peak The real case: Some 1500 peaks are observed for a protein of 75 aminoacid s AAAB NOESY experiment

2D NOESY Spectrum

Distance constraints NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling B0B0B0B0 I J r

The old times approachNOESY COSY Identify through space connectivities HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1) Identify through bond connectivities HN(i)-Ha(i) NOESY conn. COSY conn

La Spettroscopia NMR che utilizza sono spin 1H è solo un caso particolare della spettroscopia NMR bidimensinoale In effetti, accoppiamenti scalari e dipolari sono possibili anche tra spin diversi, es 1H e 13C 1H e 15N 13C e 15N 13C e 13C

In particolare, gli esperimenti che utilizzano accoppiamenti scalari tra spin diversi permettono di usare le 1J che di solito hanno valori maggiori e quindi danno esperimenti piu sensibili. Sarà pertanto possibile effettuare esperimenti bidimensionali dove in ciascuna delle due dimensioni si acquisicono nuclei diversi, per esempio 13C e 1H Otterremo un segnale nello spettro SE E SOLO SE abbiamo nel nostro sistema due spin (1H e 13C) che sono tra di loro accoppiati.

Questi esperimenti offrono molti vantaggi e aprono molte possibilità: 1.Spin 1H e 13C potranno essere direttamente accoppiati tra di loro aiutando la identificazione dei varigruppi e semplificando lassegnamento 2.2. Ogni picco permette di individuare due spin, semplificando il problema della identificazione dei segnali 3.Un esperimento bidimensionale offre una risoluzione molto maggiore perchéi segnali non sono separati solo in una dimensionale ma in una matrice bidimensionale, permettendo cosi lanalisi di sistemi anche piu complessi e non risolvibili in 1D

1 J couplings for backbone resonances

The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment

The 2D Hetcor experiment Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment

E possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1 H, 13 C) possibile, combinare questa possibilità con ciò che sappiamo a proposito degli accoppiamenti scalari e quindi UTILIZZARE gli accoppiamenti scalari per trasferire la magnetizzazione dauno spin 1H ad uno spin 13C ad esso scalarmente accoppiato

E possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1 H, 13 C) Inoltre possiamo combinare tutto cio con quello che sappiamo sugli esperimenti bidimensionali

Eccito (impulso a 90°) 1 H Acquisisco (t1) 1 H – Perturbo (Trasferisco la magnetizzazione da 1 H a 13 C utilizzando laccoppiamento scalare 1 J HC Acquisisco (t2) 13 C 2D HETCOR Expriment

Prima dimensione

2D HETCOR Expriment Prima dimensione

2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione

2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione

Esempio COSY

Esempio COSY N.B. In questo caso non si osserva solo laccoppiamento 3J ma si osserva una propagazione dellinformazione attraverso gli accoppiamenti scalari

Esempio HETCOR

Heteronuclear Single Quantum coherence 2D HSQC Experiment

2D HSQC Expriment Heteronuclear Single Quantum coherence

2D HSQC Experiment Prima dimensione Seconda dimensione Heteronuclear Single Quantum coherence

2D HSQC Expriment Prima dimensione Heteronuclear Single Quantum coherence

2D HSQC Experiment Seconda dimensione Prima dimensione Heteronuclear Single Quantum coherence

2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence Seconda dimensione Prima dimensione E possibile progettare esperimenti per trasferire la magnetizzazione da un nucleo allaltro anche indipendentemente dallacquisizione In questo esperimento il primo spin che viene eccitato è 1H, la magnetizzazione viene trasferita da 1H a 13C PRIMA della acquisizione della prima dimensione, che quindi è 13C. SOLO i 13C che sono accoppiati ad 1H possono essere osservati! Successivamente la magnetizzazione e di nuovo trasferita 1H utilizzando sempre laccoppiamento scalare ed alla fine osservo 1H

Eccito (impulso a 90°) 1 H Trasferisco la magnetizzazione da 1 H a 13 C utilizzando laccoppiamento scalare 1 J HC Acquisisco (t1) 13 C – Perturbo -Trasferisco la magnetizzazione da 13 C a 1 H utilizzando laccoppiamento scalare 1 J HC Acquisisco (t2) 1 H 2D HSQC Experiment

Questo tipo di esperimento si chiama anche Out and back Significa che parto da 1H, trasferisco da 1H a 13C (out), acquisisco 13C nella prima dimensione e poi torno (back) sullo stesso nucleo da cui sono partito 2D HSQC Experiment Il doppio trasferimento fa si che lesperimento sia molto piu selettivo Osservo solo 1H e 13C che sono accoppiati tra di se per effetto di 1 J

The HSQC experiment

Caratteristiche dellesperimento HSQC Non esiste la diagonale La magnetizzazione viene trasferita da 1 H al 13 C ad esso accoppiato Successivamente si acquisisce, nella dimensione indiretta, 13 C Infine si ri-trasferisce su 1 H e si osserva 1 H Tutti gli 1 H che non sono accoppiati a 13 C NON si osservano

Heteronuclear NMR OBSERVE 13 C during t 1 Transfer the information to all 1 H coupled OBSERVE 1 H during t 2 1H1H 13 C No more diagonal Each peak indicate A different H-C pair

Heteronuclear NMR OBSERVE 13 C during t 1 Transfer the information to all 1 H coupled Observe 1 H during t 2 1H 13C No more diagonal Two protons are bound to the same carbon CH 2

The HSQC experiment

Heteronuclear cases The scheme of 1J scalar couplings

The 1H- 15N HSQC experiment Heteronuclear Single Quantum Coherence

The HSQC experiment In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak Each amide NH group gives rise to one peak Detect H-N couplings Same sensitivity of a 1 H experiment (although you are observing 15 N) but much larger resolution if you can do the job (whatever is your job)

Heteronuclear NMR in proteins example: 15 N labelled proteins

The HSQC experiment In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak Each amide NH group gives rise to one peak Detect H-N couplings Same sensitivity of a 1 H experiment (although you are observing 15 N) but much larger resolution

Ca 2+ Apo 3.3 M GdmCl Loss of secondary structure elements: unfolded protein Refolding Ca M GdmCl The role of metal cofactor in protein unfolding Metal triggered protein folding

HN 1 83 HN 28 HN 32 Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ion 15 N 15 H

The need for multidimensional NMR

Troppi segnali 1 H ?

Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15 N or 13 C and 15 N, or 13 C, 15 N, 2 H 15 N Only A more effective fingerprint -characterization -folding -dynamics protein size >10000 Homonuclear 2D experiments do not have enough resolution HSQC or HMQC HSQC-NOESY or HSQC TOCSY

Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15 N or 13 C and 15 N, or 13 C, 15 N, 2 H 15 N and 13 C Scalar couplings through 13 C atoms -triple resonance -assignment -structure protein size >20000