TRASFORMAZIONI BIOTECNOLOGICHE Progetto lauree scientifiche Anno scolastico 2006/07 TRASFORMAZIONI BIOTECNOLOGICHE CLASSI 5A & 5B CHIMICA

le tecniche biotecnologiche Le tecniche biotecnologiche permettono di trasformare substrati organici, generalmente economici, in altre molecole evitando complesse e costose sintesi per via chimica. Queste tecniche hanno numerosi vantaggi: Utilizzo di substrati economici Minor utilizzo di energia Produzione di sostanze di scarto compatibili con l’ambiente

MICRORGANISMI UTILIZZATI Nelle trasformazioni biotecnolgiche si utilizzano microrganismi opportunamente scelti e\o geneticamente modificati (inoculo). I prodotti di biosintesi sono principalmente i metaboliti primari o secondari della fermentazione o della respirazione del microrganismo.

INOCULO L’inoculo è l’insieme dei microrganismi selezionati necessari alla reazione volti alla riproduzione “su vasta scala” del ceppo microbico.

METABOLITI PRIMARI E SECONDARI Metaboliti sostanze che prendono parte alle reazioni chimiche che avvengono nell'organismo oppure che derivano da esse, si dividono in: Primari : sono prodotti e trattenuti all’interno dell’organismo vivente che li produce,sono espressi in continuo. Secondari: sono prodotti (sostanze chimiche) del metabolismo che non sono essenziali per la semplice crescita, sviluppo o riproduzione;

FERMENTAZIONE Il termine fermentazione indica l'ottenimento di un composto come prodotto di trasformazione di una sostanza di partenza (substrato) ad opera di un opportuno microrganismo. La fermentazione è un processo ossidativo anaerobico svolto da organismi a carico di molecole organiche per la produzione di energia. Nella fermentazione l’accettore finale di elettroni è una sostanza organica che si riduce.

RESPIRAZIONE La respirazione cellulare è un processo ossidativo aerobico che permette di ricavare molecole energetiche come ATP a partire da carboidrati, lipidi o altri metaboliti. Quando l’accettore finale di elettroni è l’ossigeno si ottengono H2O e CO2 come prodotti finali.

BIOTRASFORMAZIONE La biotrasformazione è una trasformazione di una sostanza in un’altra tramite microrganismi sfruttando le loro capacità enzimatiche Vantaggi: Alternativa alla tecnologia chimica Riduzione dell’inquinamento Svantaggi: Tempi di lavoro lunghi Richiede totale sterilità Richiede una buona manualità Obbiettivi: Produzione di energia Disinquinamento Giungere a microrganismi geneticamente modificati

IL TERRENO DI COLTURA È una fonte di nutrimento da cui il microrganismo può trarre energia e nutrimento. Vengono riprodotte le stesse condizioni nutrizionali e chimico - fisiche dell’ambiente di provenienza del microrganismo preso in considerazione

IL TERRENO DI COLTURA Questa tecnica ci permette di allevare i microrganismi in laboratorio e di realizzare l’isolamento di ceppi puri. Non esiste un terreno colturale adatto a tutti i microrganismi.

TIPI DI TERRENO Terreni naturali o empirici: Ricchi di principi nutritivi Terreni semisintetici: Costituiti in parte da composti chimici e in parte da sostanze naturali Terreni sintetici: A differenza del terreno sopra elencato la composizione è interamente nota Terreni liquidi: Si utilizzano per far crescere abbondantemente una colonia. Terreni solidificati: Per isolare i microrganismi fino ad averli puri

TIPI DI SEMINA Premessa: in laboratorio si eseguono studi quantitativi e qualitativi sui microrganismi e occorre che essi siano in coltura pura, cioè che il ceppo da esaminare sia esente da altri microrganismi. Una coltura pura si può ottenere separando i vari microrganismi presenti in uno stesso terreno iniziale mediante tecniche dette di isolamento.

TIPI DI SEMINA In massa, in un terreno liquido. Le semine si possono eseguire: In massa, in un terreno liquido. Per strisciamento Sulla superficie di un Su piastra Petri terreno solidificato. Per spatolamento Su slant Per strisciamento In un terreno solidificabile per inclusione In massa In un terreno solidificato per infissione Tutte le tecniche sopra elencate devono essere eseguite in spazio sterile.

COMPOSIZIONE TERRENO PER LA BIOTRASFORMAZIONE Terreno liquido: n°. 5 beute (per prove di screening) da 100 ml con 20 ml di terreno COMPOSIZIONE: 5 g/L di Tryptone 2,5 g/L di Ey 1 g/L di Glucosio Terreno solido: n°.10 slant con 8 ml di terreno liquido ciascuno 0,5 g/L di Ey 20 g/L di Agar

LO SLANT Chiamati anche tubi a becco di clarino: sono provette dove viene solidificato in posizione obliqua un terreno liquido(con l’aggiunta di Agar) Con questo tipo di preparazione si osserva meglio il microrganismo e le sue fasi di crescita,inoltre si presta meglio alla semina con ansa e con ago e alla crescita di microrganismi aerobi.

STERILIZZAZIONE E DISINFEZIONE Mezzi chimici: Disinfezione : Uso di sostanze detergenti che però non garantiscono sempre anche l’eliminazione delle spore Mezzi fisici: Sterilizzazione Secco (stufa) Umido (autoclave) In laboratorio sono usati: - Calore - Radiazione - Impiego del freddo - Essicamento - Filtrazione Chiusa: quando devo garantire l’eliminazione di organismi che resistono ad alte temperature

ENANTIOMERI Gli enantiomeri sono stereoisomeri che presentano la stessa formula bruta, la stessa formula di struttura, ma diverso orientamento degli atomi nello spazio. Presentano attività ottica: una sostanza è otticamente attiva quando, attraversata da un fascio di luce polarizzata, ruota il piano di polarizzazione stesso. Due enantiomeri ruotano il piano della luce polarizzata di uno stesso angolo ma di senso opposto. Due enantiomeri sono l’uno l’immagine speculare dell’altro ma non sono sovrapponibili (chirali).

DUE ENANTIOMERI HANNO: Stesse proprietà fisiche ad eccezione della attività ottica, stesse proprietà chimiche ad eccezione della reattività nei confronti di substrati chirali. I recettori biologici hanno delle strutture spaziali specifiche. Per manifestare attività una molecola chirale deve combaciare con un recettore chirale altrimenti non avviene alcuna interazione.

COME SI SEPARANO In questa esperienza per separare i due enantiomeri del feniletanolo si è ricorso ad una biotrasformazione con un microrganismo ( bacillus stearothermophilus) Questo batterio, utilizzando sistemi enzimatici chirali, bioconverte solo uno dei due enantiomeri del feniletanolo in acetofenone (chetone). Per separare acetofenone e (R)-1-feniletanolo abbiamo utilizzato la gascromatografia su fasi chirali.

CROMATOGRAFIA Questa tecnica analitica ha lo scopo di separare i componenti della miscela sfruttando la diversa interazione dei vari componenti con un materiale fermo (fase stazionaria) e un materiale mobile (fase mobile). La fase mobile è un fluido inerte sia nei confronti della fase stazionaria che dei componenti della miscela che deve solubilizzare i componenti della miscela e trascinarli in una colonna in cui è posta la fase stazionaria. All’interno della colonna i componenti della miscela interagiscono diversamente con la fase stazionaria e la fase mobile e conseguentemente escono dalla colonna con tempi diversi.

CROMATOGRAFIA Le sostanze da separare che hanno maggiore affinità per la fase stazionaria vengono maggiormente trattenute e escono dalla colonna più tardi. Il contrario invece avviene per quelle sostanze che manifestano una maggiore affinità per la fase mobile.

GASCROMATOGRAFIA La gascromatografia è una particolare tecnica cromatografica, che ha lo scopo di separare più componenti di una miscela, sfruttando la loro diversa affinità per una fase stazionaria ( fS ) contenuta in una colonna e con cui le sostanze interagiscono trasportate da una fase mobile gassosa.

GASCROMATOGRAFIA La fase mobile è un gas che deve avere: Elevato grado di purezza; Inerzia chimica nei confronti della fS e verso i componenti della miscela; Possibilmente una elevata densità (o PM) per minimizzare il fenomeno della diffusione molecolare longitudinale che provoca allargamento dei picchi e quindi una diminuzione dell’efficienza; Compatibilità con il rivelatore; Basso costo. La fase stazionaria può essere: Solida ( GSC ) Liquida supportata da materiale solido ( GLC )

LE COLONNE PER GASCROMATOGRAFIA POSSONO ESSERE DI DUE TIPI: Colonna impaccata : - diametro interno 0.75 ÷ 4 mm - lunghezza fino a 10 m - la fs occupa tutto il volume interno della colonna - possono essere di acciaio o vetro. Colonna capillare: - diametro interno 0.1 ÷0.75 mm - lunghezza da 15 ÷ 100 m - in silice rivestite da materiale plastico di protezione - la fs riveste solo la parete interna.

SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO

CROMATOGRAFIA SU FASI CHIRALI Nel nostro caso la miscela conteneva sostanze otticamente attive e perciò si è utilizzata la cromatografia su fasi chirali, che prevede la formazione di diasteroisomeri mediante l’interazione dinamica reversibile delle specie da separare con uno specifico “mezzo chirale”, rappresentato in genere dalla fS della colonna utilizzata. I diasteroisomeri formatisi hanno tempi di ritenzione diversi.

Cromatogramma dei due enantiomeri

Cromatogramma ottenuto dopo l’azione del microrganismo:

CONCLUSIONE Seppure il terreno di coltura sia stato realizzato attenendoci alle metodiche operative, non riproduce le stesse condizioni nutrizionali e chimico - fisiche dell’ambiente di provenienza del nostro microrganismo, perciò si è verificato un piccolo accrescimento nel terreno liquido e quasi assente in quello solido. In base all’esperienza acquisita nei laboratori universitari l’enantiomero L viene completamente biotrasformato dal bacillo. Nel cromatogramma ottenuto al termine della nostra esperienza, sono visibili 3 picchi di cui il primo corrispondente al chetone e gli altri corrispondenti ai due enantiomeri. Possiamo concludere che la parziale biotrasformazione sia dipesa da una modificazione genetica del microrganismo o da altri fattori accidentali non facilmente identificabili.