TRASPORTO

Trasporto del K+ nei batteri: gli ionofori mobili Trasportano gli ioni per diffusione attraverso la membrana Tipicamente catalizzano il trasporto di 1000 ioni/s La selettività e discriminazione fra ioni e’ altissima Sono influenzati dalla fluidità della membrana Eteri corona e criptandi

VALINOMICINA È un antibiotico naturale che coordina selettivamente lo ione K+. Il complesso risultante passa la membrana cellulare del batterio. Lo ione K+ depolarizza la membrana uccidendo la cellula. La capacità di trasportare il Na+ è 10000 volte inferiore

Canali ionici per il trasporto del K+ Sul lato interno della membrana c’è un poro che porta ad una cavità centrale di circa 1 nm in diametro. Gli ioni K+ idratati arrivano nella cavità attraverso il poro e qui si concentrano. Al di sopra della cavità il tunnel si contrae a formare un filtro selettivo per dimensioni che assomiglia ai pioli di una scala a chiocciola e che espone all’interno atomi di ossigeno di gruppi carbonilici. Questi formano una sequenza di siti di coordinazione che consente agli ioni K+ di attraversare il canale velocemente. Lo ione K+ si sposta tra siti di coordinazione adiacenti. I legami di coordinazione sono deboli e si formano e si rompono velocemente. In questo modo il K+ viene direzionato e non intrappolato.

[K+] citoplasmatico >> [K+] extracellulare Il K+ esce spinto dal suo GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE. L’interno della cellula resta carico negativamente. La negatività all'interno della membrana trattiene il K+(carica positiva) Si raggiunge un equilibrio tra le forze che spingono fuori il K+(gradiente di concentrazione) e quelle che lo trattengono all'interno (forze elettriche) quando il valore di potenziale di membrana è di -90 mV. I siti del canale sono occupati alternativamente da ioni K+ e da molecole di acqua. Si passa da coordinazione cubica a coordinazione ottaedrica (4 ossigeni planari e due molecole di acqua)

Principali funzioni biologiche del Ferro Fe è il metallo di transizione più abbondante negli esseri umani (da 4,2 a 6,1 g in un adulto). Si trova, in una grande quantità di biomolecole. Le sue funzioni biologiche più conosciute riguardano i processi di trasferimento elettronico e trasporto e attivazione di ossigeno molecolare   Principali proteine di Fe in un uomo adulto: Proteina Funzione e (eme); ne (non eme) Mioglobina Immagazzinamento di O2 (e) Emoglobina Trasporto di O2 (e) Transferrina Trasporto di Fe (ne) Ferritina Immagazzinamento di Fe (ne) Citocromo c Trasporto di elettroni (e) Citocromo ossidasi Trasformazione O2  H2O (e) Citocromo P450 Attivazione e incorporazione di ossigeno (e) Proteine Fe-S Trasporto di elettroni (ne) Ribonucleotide riduttasi Trasformazione RNA  DNA (ne) Catalasi Metabolismo di H2O2 (e) Perossidasi Metabolismo di H2O2 (e)

In natura, il Fe(III) è presente in composti “quasi” insolubili Strategia per assimilarlo Il ferro libero dentro la cellula è tossico ed induce reazioni radicaliche dannose Strategia per stoccarlo fino al suo utilizzo finale

Assimilazione del ferro Fe(OH)3(s) Fe3+(aq) + 3 OH-(aq) Kps = 10-38 !!!! La maggior parte dei microrganismi aerobi può captare quantità controllate di Fe. Se si produce una deficienza di questo elemento essi ricorrono all’ambiente circostante liberando degli ionofori chiamati siderofori, capaci di reagire con il Fe(III), complessarlo, renderlo mobile e incorporarlo nella cellula. Caratteristiche dei siderofori: ce ne sono più di 200 PM inferiore a 1000 Da coordinano il Fe3+ formando complessi chelati molto stabili di geometria ottaedrica coordinano ione metallico hard con atomi di ossigeno costanti di formazione del complesso molto elevate (Kf = 1049) si suddividono in due classi

idrossamati catecolati batteri Lieviti e funghi Atomi leganti hard Affinità per Fe(III) hard più che per Fe(II)

MECAM modello sintetico enterobactina MECAM modello sintetico Riconoscimento recettoriale

I complessi Fe3+/ enterobactina, attraversano la membrana cellulare del microrganismo per mezzo di recettori specifici e di proteine di trasporto, e passano all’interno senza subire modifiche [V. Braun, Science 282 (1998) 2202]. Data l’enorme stabilità del complesso (Kf= 1049), come è possibile nel citoplasma il rilascio del ferro? Ci sono due meccanismi: Riduzione enzimatica del Fe3+ a Fe2+. Lo ione ferroso è molto meno hard e quindi la stabilità del complesso diminuisce in modo significativo e dissociando consente il rilascio del ferro. Nel caso dei catecolati è probabile che i gruppi estere del ciclo del legante subiscano idrolisi (da parte di esterasi), con apertura del ciclo e distruzione del complesso

Tossicità del ferro libero Il Fe viene incorporato come Fe(II), che è relativamente solubile in acqua a pH neutro. La sua esistenza allo stato libero è pericolosa Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH. Reazione di Fenton Nella membrana cellulare OH. + RH H2O + R. R. + O2 ROO. ROO. + RH ROOH + R. .RH + .RH HR-RH Autoossidazione radicalica inizio propagazione termine Perciò gli organismi viventi hanno dovuto sviluppare meccanismi sofisticati per trasportare ed immagazzinare il ferro

Transferrina  I mammiferi hanno sviluppato un sistema di trasporto e immagazzinamento complesso. Nel metabolismo del ferro, non esiste un meccanismo escretorio specifico. Il metallo disponibile viene riutilizzato più volte e in individui sani è necessario soltanto una ripristino limitato attraverso la dieta. A questo fine il ferro ingerito è assorbito principalmente dalle cellule dell’intestino e passa nel sangue, dove trova un trasportatore (la transferrina) che lo porta alle cellule del midollo osseo dove viene utilizzato per sintetizzare emoglobina (forma nella quale si trovano i due terzi del contenuto del metallo nell’organismo). Una parte del Fe passa nelle cellule del fegato e in quelle di altri organi per formare altre metalloproteine. Quando tutte queste biomolecole sono catabolizzate (fegato, milza), il ferro viene immagazzinato dalla ferritina. Da qui viene reso mobile un’altra volta e preso dalla transferrina.

Transferrine In generale, esse agiscono come agenti antibatterici in questi fluidi perché, con il sequestro del ferro presente negli stessi, impediscono lo sviluppo dei microrganismi, che hanno bisogno del metallo per svilupparsi. Servono, inoltre, per: - solubilizzare il Fe(III) che, diversamente, sarebbe insolubile a pH fisiologico; - si legano saldamente al metallo, riducendone la reattività (Kf = 1020) - facilitano il rifornimento di ferro alle cellule. Sono glicoproteine (PM 80kDa) costituite da due lobi, ognuno contenente un sito per il ferro.

sito attivo della lactoferrina Una molecola di transferrina lega due ioni Fe3+ e una quantità stechiometricamente uguale di ione CO32- Fe3+ viene coordinato in geometria ottaedrica grazie alla presenza dello ione carbonato. Attorno al ferro c’è ambiente hard di leganti. Il legame dello ione carbonato (legante bidentato) chiude la proteina che è riconosciuta dai recettori di membrana solo in questa forma (cioè quando trasporta il ferro). La coordinazione dello ione Fe3+ dipende dalla presenza dello ione carbonato.

Meccanismo di trasporto cellulare di ferro mediato dalla transferrina Il meccanismo di trasporto del Fe all’interno degli eritrociti è un esempio di endocitosi mediata da un recettore. La metalloproteina si unisce a un recettore specifico della membrana (che non ha affinità per l’apotranferrina). La parte interna della stessa si ricopre con un reticolo formato da una proteina chiamata clatrina, che aiuta a formare prima una borsa e poi una vescicola (endosoma), la cui membrana contiene pompe protoniche che consumano ATP e sono capaci di modificare il pH interno fino a portarlo a un valore fra 5,5 e 6. In queste condizioni la metalloproteina, con la protonazione dell’anione carbonato e dei leganti tirosinato, perde il ferro, che si sposta fino al citosol probabilmente attraverso un trasportatore specifico. Una volta lì esso può essere immagazzinato come ferritina o essere utilizzato. La apotransferrina, ancora nella vescicola, si diffonde nuovamente verso il plasma dove viene liberata a opera del recettore e può tornare a cominciare il ciclo.

Ferritina: meccanismo di immagazzinamento del ferro La ferritina è (con la emosiderina) il sistema di immagazzinamento del ferro. La ferritina è una proteina solubile in acqua di 440 kDa (la apoferritina). Ha 24 subunità equivalenti, disposte in geometria sferica con diametro di ca. 12 nm con una cavità interna vuota di ca. 7,5 nm di diametro. Questa si riempie di Fe(III) inorganico formando un deposito. La cavità può immagazzinare fino a 4500 ioni metallici, anche se il contenuto tipico è 1200. Se si tiene conto che ciascuna subunità ha circa 175 aa, la capacità massima di immagazzinamento è approssimativamente un Fe per residuo.

Nelle subunità si distinguono due tipi di canali: Otto canali triangolari idrofilici (aspartati e glutammati) Sei canali quadrati idrofobici (leucina) Il Fe(II) entra attraverso i canali idrofilici. Una volta all’interno, esso è ossidato dall’O2 che è entrato per i canali idrofobici a Fe(III) e immagazzinato in un tipico processo di biomineralizzazione (come ossido e idrossido). Core inorganico Asp Glu Fe2+ Leu O2 Fe3+

Ferritina: meccanismo di rilascio del ferro Molecola piccola di riducente Core inorganico Fe2+ Agente chelante Non tutto il ferro immagazzinato è Fe3+. Rimane una piccola quantità di Fe2+ importante per la veloce mobilizzazione del minerale

Assimilazione del cis-platino Pt Cl NH3 Il complesso è piano quadrato Farmaco antitumorale indicato per tumori ai testicoli e alle ovaie La sua scoperta è stata casuale In commercio dal 1978 E’ somministrato per via endovenosa Effetti collaterali: nausea, vomito Nuovi analoghi: complessi di platino piano quadrati (cis) con due leganti amminici e due alogenuri o carbossilati

Equilibrio di idrolisi è spostato a sinistra Nel sangue [Cl-] = 0.1 M Equilibrio di idrolisi è spostato a sinistra Pt Cl NH3 + H2O + Cl- H2O + Il complesso resta neutro e passa la membrana della cellula bersaglio per diffusione passiva

Equilibrio di idrolisi è spostato a destra Nel citoplasma [Cl-] = 0.003 M + H2O + Cl- Pt Cl NH3 H2O + Il complesso diventa carico e non può più passare la membrana per uscire dalla cellula bersaglio

Queste forme interagiscono con DNA che è negativo La reazione di idrolisi può andare ulteriormente avanti Pt Cl NH3 H2O + H2O Pt H2O NH3 2+ + Cl- H2O NH3 Pt - H+ HO NH3 Le specie formate sono tutte cariche positive Pt NH3 L Queste forme interagiscono con DNA che è negativo

Pt Cl NH3 H2O + Veloce G Pt NH3 Cl lenta - H2O Meccanismi difensivi ad opera di glutatione Perché il trans platino non ha attività antitumorale? NH3 Cl 195Pt NMR è la tecnica usata per studiare gli addotti del platino con il DNA

ASSIMILAZIONE E TOSSICITA’ DEL CROMO ESAVALENTE CrO42- passa la membrana attraverso un canale specifico per anioni nel citoplasma viene ridotto dal glutatione il Cr(III) non può più uscire dalla cellula ed è capace di legare il DNA

Mioglobina: TRASPORTO E STOCCAGGIO DELL’O2 singola catena polipeptidica contenente un gruppo eme localizzato in una tasca tra due aeliche. È localizzata nei muscoli e serve ad immagazzinare l’O2

Emoglobina: tetramero contenente 4 gruppi eme. È localizzata nei globuli rossi del sangue e trasporta l’O2 dai polmoni in periferia.

Il gruppo eme Composto di coordinazione Tra Fe(II) e protoporfirina IX

La curva della mioglobina è iperbolica. La curva della emoglobina è sigmoidale Perché emoglobina modula la sua affinità per l’O2 e la mioglobina no? Eppure hanno il medesimo gruppo prostetico…..

Fe(II) alto spin pentacoordinato Fe(II) alto spin pentacoordinato. Istidina distale lega l’eme alla proteina. Raggio ionico troppo grande per allocare il Fe(II) nel piano. O2 coordina nella sesta posizione e Fe(II) passa a basso spin. Raggio ionico diminuisce e il metallo entra nel piano della porfirina, tirando con sé l’istidina prossimale e l’aelica. EFFETTO COOPERATIVO

Perché il Fe(II) dell’eme deve essere ad alto spin con elettroni spaiati per coordinare velocemente l’O2? L’O2 ha elettroni spaiati? Molecola di O2 secondo la teoria VB Diamagnetica senza elettroni spaiati

In realtà l’O2 è paramagnetico. La teoria VB non è in grado di spiegare il paramagnetismo di O2, occorre ricorrere alla TEORIA DEGLI ORBITALI MOLECOLARI Gli orbitali molecolari sono funzioni matematiche che descrivono il comportamento degli elettroni nella molecola il quadrato della funzione matematica esprime la probabilità di trovare l’elettrone nella molecola gli orbitali molecolari sono una combinazione lineare degli orbitali atomici che prendono parte alla formazione dei legami nella molecola Consideriamo la molecola di H2: Siano cA e cB le funzioni dei due orbitali atomici 1s dei due atomi di H, che costituiscono il set di base L’orbitale molecolare di H2 è: = cAcA + cBcB y= cA + cB Dove i coefficienti cA e cB mostrano l’entità del contributo di quell’orbitale atomico all’orbitale molecolare

MO di antilegame MO di legame

Perché H2 esiste? Perché He2 non esiste?

Gli MO si distinguono in s e p. Per le molecole biatomiche mononucleari del secondo periodo, il set di base è costituito da orbitali 1s e 2s e da tre orbitali 2p. La formazione degli MO richiede che siano rispettate le seguenti regole: gli OA che si combinano devono avere energia confrontabile. Per esempio, 1s e 1s ma non 1s e 2s le superfici orbitaliche si devono sovrapporre il più possibile gli OA che si combinano devono avere la giusta simmetria Gli MO si distinguono in s e p. I s si formano dalle seguenti sovrapposizioni: - Due orbitali s, -Un orbitale s e uno p con la giusta orientazione, Due orbitali p testa-testa

Gli MO p si formano dalla sovrapposizione laterale di OA p

Il diagramma di energia degli MO diventa il seguente: I s hanno sovrapposizioni maggiori quindi sono i più stabili in energia nei confronti con i p

Diagramma degli orbitali molecolari della molecola di O2 s* 2s s s* 2p p p* 2 elettroni spaiati S= 1 La molteplicità 2S+1 = 3 Ordine di legame =(6-2)/2= 2 Allo stato fondamentale 3O2

Basso spin, S = 0 Alto spin, S = 2 His prossimale His prossimale O2 Fe His prossimale Piano anello porfirinico O2 Fe His prossimale Piano anello porfirinico Alto spin, S = 2 Basso spin, S = 0 Fe(II) alto spin è paramagnetico e può coordinare velocemente l’O2 che è paramagnetico (stato di tripletto) La forma ossigenata invece è diamagnetica. Questo risultato si può spiegare con due ipotesi

Fe(III) basso spin + O2-. legato Forma ossigenata è diamagnetica: come si spiega? Fe(II) alto spin Forma deossigenata è paramagnetica S = 2 Pauling Fe(II) basso spin + 1 O2 legato Weiss Fe(III) basso spin + O2-. legato . + Fe O - . Evidenze a supporto di entrambe le ipotesi