di un campione e anche di effettuare analisi di tipo quantitativo. Le interazioni delle radiazioni elettromagnetiche con la materia offrono l’opportunità di indagare in vario modo sulla natura e sulle caratteristiche di un campione e anche di effettuare analisi di tipo quantitativo. Le tecniche ottiche ed i metodi di analisi che da esse derivano si basano su queste interazioni e sui fenomeni coinvolti.

La radiazione elettromagnetica è una forma di energia che si propaga. È un’onda elettromagnetica caratterizzata dai seguenti parametri: - lunghezza d’onda (λ), cioè la distanza fra due punti successivi in fase tra loro (ad es. fra due massimi o due minimi) - frequenza (ν), cioè il numero di oscillazioni al secondo, ovvero il numero di onde che transitano per un punto in un secondo - ampiezza (A) cioè il massimo spostamento di un punto rispetto alla posizione di equilibrio - intensità (I) cioè l’energia che l’onda trasporta in 1 secondo attraverso una superficie di area unitaria perpendicolare alla direzione di propagazione.

A ogni radiazione elettromagnetica è associata una energia: l = c / n E = hn =hc / l L’insieme di tutte le radiazioni elettromagnetiche costituisce lo spettro elettromagnetico. Radiazioni percepite dall’occhio

Negli atomi: i livelli energetici atomici sono discreti e le transizioni elettroniche permesse a seguito dell’assorbimento di luce sono caratteristiche di ogni elemento Energia 1s 2s 2p 3s 3p 4s 4p 3d 5s 5p 4d

Nelle molecole: anche gli orbitali molecolari che descrivono le molecole sono quantizzati. A seguito dell’assorbimento di radiazione elettromagnetica si ha transizione elettronica da un orbitale molecolare occupato ad uno vuoto a più alta energia

Non tutti gli orbitali atomici possono per energia o per simmetria partecipare alla formazione di orbitali molecolari: questi rimangono imperturbati dal legame e sono detti di NON LEGAME (n). Essi contengono coppie isolate di elettroni s s* p p* n energia

Una molecola ha una sua energia interna che è la somma di contributi diversi: Emolecola = Enucleo + Eelettronica + Evibrazionale + Erotazionale + Etraslazionale Energia richiesta per le transizioni Durante l’assorbimento, la cattura dell’energia della radiazione fa aumentare l’energia interna dell’atomo o della molecola, provocando una serie di fenomeni diversi a seconda della lunghezza d’onda (e quindi dell’energia) della radiazione: le radiofrequenze (che sono poco energetiche) sono in grado di interagire solo con lo spin di alcuni nuclei le microonde inducono rotazioni nelle molecole le radiazioni IR amplificano le vibrazioni dei legami in una molecola le radiazioni UV/visibile riescono ad eccitare gli elettroni di valenza i raggi X riescono addirittura ad estrarre gli elettroni più vicini al nucleo.

Modello quantomeccanico: una radiazione può essere considerata con un flusso di fotoni, che sono particelle prive di massa ma dotate di una specifica energia. E= hn Dove E è l’energia, h è la costante di Planck (6.63 x 10-34 Js) e n è la frequenza. L’energia di un fotone con lunghezza d’onda di 100 nm è 1,99 x10-18 J L’energia di un fotone con lunghezza d’onda di 1000 nm è 1,99 x10-19 J

Una molecola interagisce con un fotone A + hn A* Se si considera una mole di fotoni, l’energia associata è: 1,99 x10-18 x NA = 1198 KJ per fotoni di 100 nm 1,99 x10-19 x NA = 119,8 KJ per fotoni di 1000 nm Questi valori di energia sono dello stesso ordine di grandezza di quelli richiesti per rompere i legami chimici. Pertanto quando una molecola assorbe un fotone di luce guadagna una quantità di energia tutt’altro che trascurabile. Lo stato eccitato della molecola ha un tempo di vita breve e tende a tornare allo stato fondamentale perdendo l’energia acquisita sotto forma o di calore o di radiazione (emissione) o entrambe.

Spettrofotometria UV-visibile

s* energia p* n p s SPETTROFOTOMETRIA UV/VISIBILE 1) 10- 200 nm UV lontano 2) 200-400 nm UV vicino 3) 400-800 nm visibile Per i composti organici transizioni s-s* (l tra 110-135 nm) sono tipiche di molecole sature che contengono solo legami semplici s s* p p* n energia transizioni p-p* e n-s* (l tra 160-225 nm) Le transizioni p-p* sono tipiche di composti insaturi contenenti cioè doppi legami isolati o coniugati. transizioni n-p* (da l 285 nm in su) Le transizioni n-s* e n-p* coinvolgono eteroatomi con doppietti di non legame come l’ossigeno in C=O, l’azoto e lo zolfo

Separazione p-p* in molecole con doppi legami coniugati …e le porfirine?

Spettro di assorbimento di una porfirina Banda di Soret (circa a 420 nm) è transizione p-p*. Anche le bande nel visibile (responsabili del colore) sono di questo tipo. Sono 4 nell’anello non coordinato e diventano solo 2 quando vi è uno ione metallico coordinato. La presenza dello ione metallico quindi non è direttamente responsabile del colore, ma fa variare il numero e la posizione delle bande. Da ciò si ricavano informazioni sullo stato di ossidazione del metallo (es. Fe(III) e Fe(II)). Inoltre sostituenti che aumentano la delocalizzazione del sistema p provocano lo spostamento delle bande a lunghezze d’onda maggiori. IV II III I

Lo spettro elettronico dipende dallo stato di ossidazione del ferro.

Lo spettro elettronico dipende dalla specie coordinata all’eme.

Ci sono esempi di complessi con metalli di transizione (Fe, Cu, Mn, Mo) di macromolecole biologiche, in particolare coinvolti nei processi di trasferimento elettronico, che presentano assorbimento nel vicino UV e nel visibile, anche in assenza di estesi sistemi delocalizzati (es. proteine ferro-zolfo, plastocianine e in generale blu-rame proteine). Nella colorazione di questi complessi risultano coinvolti gli elettroni “d” del metallo. Si parla di transizioni d-d bande di trasferimento di carica (CT: charge transfer). Si tratta, in generale, di transizioni in cui un elettrone che si trovava in un orbitale molecolare localizzato su una certa parte della molecola o di un complesso, viene trasferito in un orbitale vuoto localizzato su una parte diversa della molecola (o complesso). Nel caso di complessi di metalli di transizione, si può avere il trasferimento da un orbitale d del metallo ad un orbitale molecolare di antilegame dei leganti (MLCT), o viceversa da un orbitale occupato nei leganti ad un d vuoto del metallo (LMCT).

Fotosintesi: l’assorbimento della luce solare è garantito dalla presenza di diversi pigmenti organici. Clorofilla, che è l’anello tetrapirrolico contenente Mg2+, è la specie che assorbe luce (il coefficiente di estinzione molare è circa 105 M-1 cm-1). La catena idrofobica lunga lega saldamente la clorofilla alla membrana del cloroplasto. Gli altri pigmenti completano l’assorbimento delle clorofille e consentono di coprire un intervallo di assorbimento spettrale molto più ampio.

La rosa dei colori Quando un raggio di luce policromatica illumina un oggetto e questo ne assorbe solo una parte, la radiazione trasmessa raggiunge l’occhio. A questa è associata la sensazione visiva del colore. Se un oggetto assorbe tutte le radiazioni visibili che riceve appare nero, Invece se un oggetto non assorbe radiazioni del visibile appare bianco

La sensazione visiva di un determinato colore dipende dalla composizione spettrale della sorgente luminosa. Per esempio se un oggetto appare giallo, i casi sono tre: la sorgente emette radiazione monocromatica a 580 nm (che corrisponde al giallo) e l’oggetto non è in grado di assorbirla per cui la trasmette e quindi appare giallo. 2) la sorgente emette luce bianca (il campo spettrale da 400-800 nm) e l’oggetto assorbe le radiazioni complementari al giallo 3) la sorgente emette due radiazioni monocromatiche (per esempio a l=650 nm (rossa) e l=530 nm (verde)) che non vengono assorbite e quindi raggiungono l’occhio combinandosi: perciò l’oggetto appare giallo.

A seguito dell’assorbimento, l’intensità misurata a valle di un campione irraggiato può essere minore di quella della radiazione incidente. Questo concetto sta alla base di tutte le tecniche spettroscopiche di assorbimento!!! I0 I0 I0 I<I0

SORGENTI Le lampade possono emettere nel campo spettrale dell’UV o del visibile. Devono emettere in modo continuo senza cali di potenza. Per la regione del visibile si usano lampade a filamento di tungsteno o lampade tungsteno-alogeno che forniscono energie più elevate nell’intervallo 300-400 nm. Per la regione dell’UV si usano lampade a scarica riempite di gas deuterio (D2): il deuterio viene eccitato dalle scariche elettriche prodotte da un arco ed emette uno spettro continuo di radiazioni al di sotto di 400 nm.

MONOCROMATORI Le lampade emettono radiazioni in tutte le direzioni dello spazio e quindi per ottenere un fascio di luce sottile e ben focalizzato è necessario un sistema ottico costituito da lenti, specchi e fenditure. Il fascio viene poi indirizzato sul monocromatore che scompone la radiazione policromatica (per es. la luce bianca) in bande il più possibile monocromatiche. A seconda del principio fisico su cui si basano, i monocromatori si dividono in: -filtri, che assorbono una parte delle componenti spettrali della radiazione proveniente dalla sorgente e ne trasmettono una gamma più o meno ampia -prismi o reticoli che diffrangono la luce policromatica separandola nelle diverse componenti monocromatiche.

CELLE Le celle o cuvette sono di vario tipo. Normalmente sono a forma di parallelepipedo di sezione quadrata con cammino ottico di 1 cm. Per campioni molto diluiti sono disponibili celle da 4 cm e per campioni molto concentrati ci sono celle con cammino ottico di 1 e 2 mm. Per la regione UV, la cella deve essere di quarzo, mentre per la regione visibile vanno bene sia il vetro che la plastica. Le celle di quarzo possono essere usate anche nel visibile. Ci sono anche microcelle con cammino ottico di 1 cm ma adatte per contenere piccoli volumi di soluzione.

RIVELATORI Trasformano l’energia radiante in un segnale elettrico. Ci sono vari tipi di rivelatore: Fototubi (si basano sull’effetto fotoelettrico) Un fototubo è un tubo da un catodo, detto fotocatodo, di grande area, e da un anodo; gli elettrodi, contenuti in un'ampolla di vetro in cui si è fatto il vuoto spinto, sono sottoposti ad un'elevata differenza di potenziale. Quando i fotoni colpiscono il catodo, costituito di materiale fotoemittente, causano la fuoriuscita di elettroni, i quali, accelerati dal campo elettrico prodotto, si muovono verso l'anodo, posto a potenziale superiore rispetto al catodo. La raccolta degli elettroni da parte dell'anodo permette di ottenere una corrente elettrica in uscita dal fototubo, corrente la quale rispecchia il flusso luminoso che colpisce il dispositivo; la relazione che lega le due grandezze è praticamente lineare.

RIVELATORI Fotomoltiplicatori (si basano sull’effetto fotoelettrico) Sono una variante dei fototubi ma hanno sensibilità maggiore. Gli elettroni emessi dal fotocatodo vengono accelerati da una differenza di potenziale verso una superficie metallica che espelle altri elettroni che a loro volta vengono accelarati verso un'altra superficie metallica. Si ottiene una notevole amplificazione del segnale. Dopo più passaggi si raccolgono gli elettroni sull'anodo.

Spettrofotometri moderni sono a doppio raggio. In essi il raggio uscente dal monocromatore viene sdoppiato: i due raggi ottenuti di intensità I0 (intensità è il numero di fotoni che incidono sul campione nell’unità di tempo) vengono inviati rispettivamente uno al campione e uno al riferimento posti in due cuvette uguali. Il raggio emergente dal riferimento avrà intensità inalterata, dato che non vi è stato assorbimento, mentre il raggio uscente dal campione avrà una intensità I<I0, in quanto una parte della radiazione incidente è stata assorbita. Le due intensità I e I0 raggiungono il dispositivo di lettura che ne effettua il rapporto

TRASMITTANZA T = I/I0 ASSORBANZA A = -logT= log I0/I

Spettro di Assorbimento Metilarancio (MeO) nm

A a C A = el * l * C LEGGE DI LAMBERT BEER A=log I0/I A lunghezza d'onda, nm A 350 400 450 500 550 600 650 700 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 C= 8 x10-5 M C = 4 x 10-5 M C = 2 x 10-5 M C = 1 x 10-5 M

A = el * l * C A è adimensionale A=log I0/I l è in cm C è molare el è M-1cm-1

La legge di Lambert-Beer è valida per radiazioni monocromatiche e soluzioni diluite È valida solo per soluzioni diluite (< 10-2 M) All'aumentare della concentrazione aumenta il numero di particelle in soluzione ed aumenta anche il numero di urti fra queste; le forze interioniche e/o intermolecolari aumentano e possono formarsi molecole o aggregati di particelle più complesse, diverse per struttura da quelle in esame, per cui si potrà avere uno spostamento del massimo di assorbimento. e dipende dall’indice di rifrazione del mezzo che, per concentrazioni elevate, dipende a sua volta dalla concentrazione. Limiti strumentali Radiazione incidente non perfettamente monocromatica