IPERCOLESTEROLEMIA FAMILIARE (FH) Trasmissione: autosomica dominante frequenza: 1 malato: 500 nati sani patogenesi: gli individui malati (sia etero- che omozigoti) sono portatori di mutazioni sul gene che codifica per il recettore delle LDL. Il difetto genico si fa risentire soprattutto a livello degli epatociti, preposti alla captazione e degradazione delle LDL circolanti. La mancata eliminazione delle LDL a livello epatico determina un'aumento dei livelli di LDL (e quindi colesterolo) in circolo che a sua volta determina gravi manifestazioni cliniche (vedi oltre) Sugli epatociti il recettore per le LDL è promiscuo con le IDL, quindi la sua mancanza determina un aumento delle IDL in circolo che, non venendo direttamente rimosse, vengono trasformate in LDL, aumentando ulteriormente il grado di ipercolesterolemia.

TRASPORTO E METABOLISMO INTRACELLULARE DEL COLESTEROLO la complessazione con l'LDL determina il "clustering" dei recettori che prendono contatto con la clatrina. Quest'interazione è necessaria alla formazione della fossetta rivestita e quindi all'internalizzazione delle LDL apoproteina B-100 LDL core (esteri del colesterolo) recettore per le LDL, riconosce la apoproteina B-100 presente su LDL e IDL fossetta rivestita clatrina vescicola rivestita epatocita

TRASPORTO E METABOLISMO INTRACELLULARE DEL COLESTEROLO recettore per LDL ri-esposto Vescicola rivestita immagazzinamento (sotto forma di esteri del colesterolo) vescicola di ricircolo endosoma sintesi di componenti della membrana cellulare, ormoni steroidei, acidi biliari aminoacidi (metabolismo) ACAT lisosoma Colesterolo libero

- - + TRASPORTO E METABOLISMO INTRACELLULARE DEL COLESTEROLO esterificazione (immagazzinamento) del colesterolo apparato del Golgi + Enzima ACAT disponibilità eccessiva di colesterolo - ribosomi - Enzima HMG-Coa reduttasi RER RNA sintesi del recettore per le LDL sintesi endogena del colesterolo DNA

IL GENE PER IL R-LDL E LA SUA STRUTTURA PROTEICA 5' HOOC NH2 Sequenze promoter Dominio di legame per LDL (292 aa) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 trascrizione Dominio di omologia per l'EGF (400 aa) splicing Dominio di glicosilazione (58 aa) traduzione Modificazioni post-traduzionali Dominio trans-membrana (58 aa) Dominio citoplasmatico (50 aa) 3'

IL GENE PER IL RECETTORE DELLE LDL E LE MUTAZIONI CHE DETERMINANO LA FH inserzione delezione G>A nonsenso missenso + 2 kb + 18 nt + 4 nt D splicing + 7 kb (duplicazione) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 -1 kb -10 nt -4 kb -5 kb -5 kb -7 kb -20 kb -25 kb

EFFETTI DELLE MUTAZIONI SUL GENE PER IL R-LDL Sono state finora evidenziate centinaia di mutazioni diverse sul gene per il recettore delle LDL che a livello fenotipico danno origine ad effetti raggruppabili in quattro classi: recettore negativo (mancata sintesi): la mutazione genica determina la mancata traduzione del recettore per le LDL recettore negativo (mancato trasporto al golgi): la mutazione genica determina la mancata maturazione del prodotto genico e la sua conseguente esposizione sulla membrana delle cellule recettore deficiente: la mutazione genica determina la sintesi di un recettore caratterizzato da una capacità limitata di legare le LDL (da 1 a 10% del recettore wild type) internalizzazione deficiente: la mutazione genica determina la sintesi di un recettore normalmente in grado di legare le LDL ma incapaci di internalizzarle all'interno delle cellule

MUTAZIONI CHE DETERMINANO LA FH recettore negativo (mancata sintesi) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 -20 kb FH siracusa La mancanza del promotore impedisce completa-mente la normale trascrizione dell'allele mutato Si verifica quindi un deficit quantitativo dell'R-LDL espresso sulla superficie degli epatociti. Tale deficit sarà totale o parziale a differenza dell'assetto genotipico (etero-omozigote)

MECCANISMO DI SPLICING (PROCESSAMENTO) DELL'RNA TRASCRITTO PRIMARIO DI RNA GT AG 5' 3’ 5' 3’ C GT A G sequenze "consensus” permettono il corretto avvicinamento delle terminazioni di due esoni adiacenti e vengono riconosciute dagli enzimi di splicing che operano il taglio della sequenza intronica La mancanza di splicing determina la formazione di un RNA instabile che viene degradato o comunque non può essere tradotto, risultando quindi in una mancanza di proteina GT AG PROCESSING mRNA GT AG

MUTAZIONI CHE DETERMINANO LA FH G>A recettore negativo (ridotta sintesi) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 La sostituzione G > A distrugge la consensus sequence GT dell'introne 15 Ciò attiva delle consensus sequences criptiche presenti o nell'esone 15 o nell'introne 15 In queste condizioni lo spicing del trascritto non è corretto e l'mRNA risultante è instabile Nelle cellule che portano questo allele si osserva una diminuzione di mRNA per il R-LDL (1/4 delle cellule sane) L'mRNA che viene tradotto da origine a R-LDL mutati (+ corti o + lunghi) dipendentemente dalla consensus sequence criptica utilizzata durante lo splicing. Questi recettori sono comunque non funzionali

MUTAZIONI CHE DETERMINANO LA FH recettore negativo (mancato trasporto al golgi) e recettore deficiente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 7 kb La mutazione determina la duplicazione degli esoni 2-6 che portano a codificare un dominio di legame duplicato NH2 La proteina così tradotta a livello del RER è instabile. Viene modificata e trasportata in super-ficie con maggiore difficoltà. Viene inoltre degra-data con maggiore velocità Alterazione del dominio di legame Alterazione delle modificazioni post-traduzionali Sulla superficie cellulare il recettore lega le LDL con affinità e capacità diminuite (30% del wild type) HOOC

MUTAZIONI CHE DETERMINANO LA FH internalizzazione deficiente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 La mutazione determina la generazione di un segnale di stop (nonsense) che blocca la sintesi del dominio intracellulare dell’ R-LDL. Lys Il recettore non può più quindi interagire correttamente con la clatrina, divenendo così impossibile la sua internalizzazione Asn Asn Arg Stop

MUTAZIONI CHE DETERMINANO LA FH internalizzazione deficiente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 La mutazione determina la sosti-tuzione non conservativa (missense) dell’aminoacido Tyr790 in Cys. La proteina risultante è della lun-ghezza corretta ma, a livello citoplas-matico perde la corretta struttura 3D, non riuscendo così ad interagire con la clatrina Tyr Cys

I sintomi non si sviluppano fino alla terza o quarta decade di vita. DIAGNOSI DELL’ FH I sintomi non si sviluppano fino alla terza o quarta decade di vita. Essendo però una malattia ereditaria, sulla base dell'anamnesi familiare si può procedere alla diagnosi precoce nel neonato: il sangue prelevato dal cordone ombelicale contiene concentrazioni di colestrolo totale doppie o triple (nel caso di eterozigoti) o addirittura di 6-8 volte maggiore rispetto alla norma (nel caso di omozigoti). La diagnosi è possibile anche in epoca prenatale, sulle cellule del liquido amniotico. Si deve quindi procedere alla diagnosi differenziale dall'ipercolesterolemia poligenica, che viene senza dubbio effettuata con la valutazione dei recettori per le LDL in colture di fibroblasti del paziente donatore. La diagnosi deve poi essere confermata dall'elettroforesi delle lipoproteine (aumento delle LDL) e da una trigliceridemia normale. Si può quindi procedere all'identificazione del tipo di difetto genico con digestione del DNA del donatore con enzimi di restrizione e analisi in southern blot .

QUADRO CLINICO DELL’ FH L'aspetto clinico più evidente è l'insorgenza di una coronaro-sclerosi accelerata che si può manifestare già verso i trent'anni. Il deposito di colesterolo a livello della valvola aortica può provocare una stenosi aortica sintomatica. I pazienti omozigoti non adeguatamente seguiti muoiono preco-cemente (entro i vent'anni) per le complicanze dell'infarto. I pazienti eterozigoti possono incorrere in infarto miocardico gia verso i trent'anni, con picco d'incidenza tra la quarta e la quinta decade di vita. Anche nelle donne si ha un'incidenza aumentata di infarto, ma l'età d'insorgenza è spostata di 10 anni rispetto ai maschi. All'età di sessant'anni più dell' 85% dei pazienti ha avuto un infarto miocardico.

Hanno dimostrato essere potenzialmente cancerogeni TERAPIA DELL’ FH Dieta povera di colesterolo. I pazienti mostrano una caduta molto limitata (circa il 10%) dei livelli di colesterolo totale. Sali biliari: Funzionano solo nei pazienti eterozigoti, in combinazione con la dieta abbassano i livelli di colesterolo totale del 20-30% Hanno dimostrato essere potenzialmente cancerogeni Il loro effetto benefico sui livelli di colesterolo plasmatico è limitato dall’attivazione della sintesi endogena di colesterolo. Per questo motivo vengono somministrati in combinazione con la Niacina: inibisce la sintesi endogena compensatoria di colesterolo a livello epatico, aumenta la produzione di HDL. Centrifughe a flusso continuo (scambio plasmatico). Deve essere effettuato ogni mese, ed è per ora il trattamento elettivo per gli omozigoti Trapianto epatico, è il più efficace, diminuisce dell'80% i livelli di colesterolo

Razionale dell’uso delle resine sintetiche che legano sali biliari: TERAPIA DELL’ FH Razionale dell’uso delle resine sintetiche che legano sali biliari: + resine sintetiche + niacina colesterolo HMG Coa sali biliari colesterolo HMG Coa sali biliari + resine sintetiche colesterolo HMG Coa - sali biliari senza terapia

DEFICENZA FAMILIARE DI APO B100 (FDB) Nella popolazione europea/nordamericana il 2-5 % dei pazienti diagnosticati con FH risultano poi essere invece affetti da FDB. Trasmissione: autosomica dominante frequenza : 1 : 500 patogenesi : gli individui malati (sia etero- che omozigoti) sono por- tatori di mutazioni sul gene che codifica per l’apo B100 (transizione G ---> A al codone 3500, che risulta nella sostituzione dell’aa Gln ---> Arg nella corrispondente posizione della proteina. La proteina viene normalmente tradotta ed assemblata nelle LDL, ma queste risultano avere una affinità marcatamente ridotta per il recettore delle LDL presente sugli epatociti. Il quadro clinico ed anche la terapia sono assolutamente sovrapponibili a quelli visti per l’FH

IPERCOLESTEROLEMIA DA FH E/O DA FDB mutazione dell’Apo B100 (FDB) LDL ipercolesterolemia mutazione dell’R-LDL (FH) Le due malattie sono praticamente indistinguibili ad una prima diagnosi Mancata internalizzazione del colesterolo

FH, FDB, ipobetalipoproteinemia Come osservato precedentemente, mutazioni su geni che codificano per proteine diverse (ad esempio apo B100 e R-LDL) possono determinare le stesse manifestazioni cliniche (ipercolesterolemia) Esiste però anche il caso in cui mutazioni sullo stesso gene possono determinare manifestazioni patologiche completamente diverse (ad esempio L’FDB e la ipobetalipoproteinemia) Ciò è dovuto alla capacità della mutazione genica di indurre alterazioni quantitative o qualitative sulla proteina codificata

IPOBETALIPOPROTEINEMIA FAMILIARE Gene per Apo B100 Più di 20 diverse mutazioni, tra le quali frame shift, non sense Mutazione puntiforme: Gla3500 --->Arg alterazioni nello splicing dell’RNA oppure generazione di peptidi non funzionali proteina normalmente tradotta minore sintesi di apolipoproteine LDL normalmente assemblate minore quantità di LDL assemblate, basse concentrazioni di LDL e di colesterolo circolanti (<10 mg/dl) quantità di LDL circolanti normali diminuisce la sintesi dei sali biliari quantità di lipidi assorbiti e trasportati normali negli ETZ: asintomatica negli OMZ: malassorbimento di grassi alimentari a livello intestinale bassa affinità per R-LDL (ipobetalipoproteinemia familiare) ipercolesterolemia (FDB)