Lez 12 Protein folding Intracellular Compartments and Protein Sorting Nucleo, mitocondri, perossisomi, reticolo endoplasmico Meccanismi di trasporto

Sintesi di una proteina funzionale Il peptide sintetizzato deve ripiegarsi (folding) poi può andare incontro a modificazioni covalenti (es. fosforilazione, glicosilazione) e legarsi a metalli o altre subunità

Folding è co-traduzionale Il folding avviene durante la sintesi, inizia dal N-terminale, ed è in gran parte spontaneo

Molten globule Nel refolding in vitro in molte proteine si forma rapidamente un intermedio: il molten globule, che ha alta struttura secondaria, ma manca di molte interazioni stabilizzanti. Ha zone indrofobiche esposte.

Protein folding Il passaggio da molten globule a struttura corretta è critico e può essere assistito da chaperoni

Molecular chaperones: hsp70 Una classe di chaperoni assiste il folding coprendo le zone idrofobiche

Hsp60 chaperones Un’altra classe di chaperoni crea le condizioni per la “denaturazione” e refolding

Controllo di qualità della sintesi di proteine

Ubiquitina

Catene di ubiquitine La ubiquitinizzazione prevede l’azione dell’enzima di attivazione, la ligasi il riconoscimento della proteina bersaglio e la formazione della catena di ubiquitine

Meccanismi per degradare le proteine Sia le ubiquitine ligasi che i segnali di degradazione devono essere attivati. Usano meccanismi in parte simili

Produzione di una proteina in eucarioti

Compartimenti di una cellula eucariota Le proteine vanno ad occupare vari compartimentidella cellula

Schema del possibile sviluppo di organelli Nucleo e mitocondrio hanno origini molto diverse

Comunicazioni tra organelli

Traffico di proteine Schema semplificato Tipi di trasporto: Gated Transmembrana vescicolare

Trasporto vescicolare Il trasporto vescicolare usa gemmazione e fusione di vescicole. I componenti solubili sono trasportati insieme a membrane. La orientazione delle molecole transmembrana e delle membrane è conservata

I segnali possono essere di sequenza di zone unite nella struttura

Trasporto attraverso il nuclear envelope Il nucleo è separato da citoplasma da una doppia membrana: il nuclear envelope Esso ha dei pori: nuclear pores che sono fatti da strutture chiamate Nuclear Pore Complex (NPC) NPC sono grossi, c.a. 125 MDa, e composti da copie multiple di nucleoporine La struttura è stata in parte determinata

Trasporto nucleare

NPC ha una struttura a tre anelli Gli anelli sono coassiali e sono collegati alle braccia radiali. Il poro centrale è all’interno

The nuclear pore complex. A: scanning electron microscopy del complesso di Xenopus B: schema del complesso

Nuclear localization signal (NLS) Per essere importate le proteine debbono avere un segnale NLS signal, e per essere esportate un NES (nuclear export signal) NLS e NES consistono di corte sequenza che sono necessarie e sufficienti alle proteine per essere trasportate attraverso i pori dentro o fuori dal nucleo Enzima fuso a NLS

Trasporto nel nuclear pore complex Molecole <50 kDa diffondono liberamente. Le altre sono trasportate da nuclear import receptors

Ran GTPase dirige il trasporto Compartimentalizzazione di Ran-GDP e Ran-GTP GAP (GTPase activating protein: Ran-GTPRan-GDP) è citosolica GEF (Guanine Exchange Factor: Ran-GDPRan-GTP) è nucleare Idrolisi di GTP da la direzione del trasporto

Il legame con Ran-GTP induce il rilascio del cargo

Le membrane nucleari si rompono nella mitosi

Trasporto nei mitocondri Mitocondri e plastidi hanno 2 membrane diverse: interna ed esterna

Trasporto nei mitocondri Le tre proteine traslocatori nella membrana mitocondriale La sequenza segnale ha la conformazione di un’alfa elica con una superficie basica

Trasporto nei mitocondri Il trasporto attraverso le due membrane avviene probabilmente nei contact sites

Trasporto nei mitocondri: energia Il rilascio delle hsp70 citosoliche consuma ATP Il trasferimento richiede pontenziale elettrochimico Le hsp70 mitocondriali consumano ATP

Hsp70 guida l’importazione delle proteine

Trasporto mitocondriale: proteine di membrana

Trasporto nei peroxisomi Il trasporto è guidato da una sequenza di 3 amino acidi di solito at C-terminale

Trasporto nel reticolo endoplasmico ER rugoso di una cellula pancreatica Colorazione di proteine dell’ER

Ribosomi liberi e legati alle membrane Gli stessi ribosomi ciclano tra poliribosomi liberi e di membrana. L’ancoraggio alla membrana avviene ad opera della proteina nascente

Separazione del poliribosomi

Trasporto nell’ ER Ipotesi originaria e semplificata. La sequenza segnale porta il ribosoma al traslocatore Il segnale è poi tagliato

Signal-recognition particle (SRP) SPR lega la sequenza segnale ed anche SPR receptor sulla membrana ER Il legame al segnale induce una pausa nella sintesi, per facilitare l’interazione con il recettore. Il complesso viene poi portato al traslocatore.

Meccanismo di trasporto nell’ER

Ribosoma legato la traslocatore Il poro del traslocatore si allinea con il tunnel del ribosoma da cui esce il peptide

Trasporto di una proteina solubile Il poro del traslocatore si apre dopo il legame con la leader sequence. Dopo la traslocazione il poro si chiude ed il traslocatore si apre lateralmente e rilascia il peptide segnale

Trasporto di una proteina transmembrana, N-terminal signal Quando il traslocatore incontra la sequenza stop-transfer, si apre e rilascia il peptide

Proteina transmembrana: internal signal Le cariche elettriche intorno al segmento transmembrana determinano la polarità della proteina. Il C-terminale può essere esterno o citosolico

Proteine di membrana Contengono da sequenze start e stop.

Glicosilazione delle proteine La parte esterna delle proteine di membrana è spesso glicosilata. Un meccanismo (N-glycosilation) usa la asparagina (Asn o N)

Ruolo di N-linked glycosilation nel folding La calnexina lega e trattiene proteine che non sono completamente foldate ed hanno un glucosio esposto. La glucosyl transferase riconosce le protiene unfolded, e le le glicosila

Esportazione e degradazione di proteine dell’ER misfolded Le proteine misfolded vengono traslocate al citosol per la degradazione

Unfolded protein response nel lievito

GPI anchor proteins