Saggio Immunoenzimatico ELISA diretto o a "sandwich”: accertare la presenza di un antigene; indiretto: accertare la presenza di un anticorpo specifico contro un antigene

ELISA DIRETTO: Ieri coating con anticorpo anti IL-2 Stamattina blocking con PBS-BSA3% CAMPIONI e curva standard: su piastra diversa preparare diluizione campioni MLR e curva standard. Campioni tal quale + 3 diluizioni 1:2, partire da volume di 250 µl, diluire in 125µl di reagent diluent Curva standard fare 7 diluizioni a partire da 2ng/ml, dil 1:2, da volume di 250 µl, diluire in 125µl di reagent diluent, 8° pozzetto SOLO reagent diluent. CONC. Iniziale rIL-2 140 ng/ml 4) 2 lavaggi con 200µl PBS-TWEEN 0,05%, poi 50 µl/well

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12

PIASTRA ELISA 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

PIASTRA “gemella” x diluizioni prepare 250µl di IL-2 2ng/ml in RD (Ci IL2 140 ng)

… PIASTRA “gemella” x diluizioni prepare 250 ul di IL2 2 ng/ml in RD (Ci IL2 140 ng) 1:2 Dilute1:2 from well A1; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A1) 1:2 Dilute1:2 from well A2; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A2) 1:2 Dilute1:2 from well A3; Vf=250 ul (125 ul RD+125 ul from A3) 1:2 … 1:2 1:2 ONLY 125 ul RD

STD 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 bianco 250 µl 125 µl

PIASTRA ELISA

PIASTRA “gemella” x diluizioni

Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes eg. hormones drugs tumour antigens cytokines 10

Direct: sandwice ELISA to detect Antigenes Coating Anti-analyte capture antibody purified 11

Blocking 2. BSA 1-3% 1. Anti-analyte 12

Standard-Sample 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte 13

Detection 4. Antibody-biotinilated 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte biotin 14

Conjugation 5. Streptavidin-enzyme HRP 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte biotin Streptavidin-HRP Sandwice ELISA (direct) to detect Antigenes 15

Substrate 6. TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) biotin Streptavidin-HRP Substrate 6. TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA 5. Streptavidin-enzyme 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte biotin Streptavidin-HRP 16

Stop reaction 7. H2SO4 1N 6. TMB 5. Streptavidin-enzyme 4. Anti-analyte-biotin 3. Sample 2. Blocking 1. Anti-analyte biotin Streptavidin-HRP 17

Analisi Quantitativa: la retta standard nel saggio diretto Sandwich, y=mx+q L’intensità della reazione colorimetrica è proporzionale alla quantità di enzima La quantità di enzima presente nel pozzetto è proporzionale alla quantità di anitcorpo secondario La quantità di anticorpo secondario è proporzionale alla quantità di ANTIGENE Quindi l’intensità della reazione colorimetrica è proporzionale alla quantità di antigene! biotin Streptavidin-HRP

Per domani portare un computer per gruppo analisi elisa sandwich

matteo.urbano@unimib.it Lab. 5013 - ed. U4, 5° piano Uff. 2027/B - ed. U3, 2° piano