Dott.ssa Anna Maria Girardi Diagnostica e Ricerca San Raffaele LaboRaf Diagnostica di laboratorio per autoimmunità non organo specifica: tecniche analitiche ed interpretazione dei risultati aaaaa Dott.ssa Anna Maria Girardi Diagnostica e Ricerca San Raffaele LaboRaf

PREMESSA La presenza di autoanticorpi è riscontrabile in un elevato numero di patologie, sia d’organo che sistemiche La corretta identificazione degli autoanticorpi associati ad un certo quadro clinico fornisce informazioni utili dal punto di vista sia diagnostico che prognostico Soprattutto per le malattie sistemiche, il singolo dato di laboratorio non è sempre di univoca interpretazione e necessita, spesso, di ulteriori approfondimenti.

Autoanticorpi organo specifici Organo bersaglio, presenza di anticorpi, alterazione della funzione d’organo: la sequenza appare ovvia, la richiesta del clinico è mirata, l’interpretazione del dato di laboratorio è semplice Autoanticorpi non organo specifici Sintomi comuni a diverse patologie, anticorpi diretti verso strutture ubiquitarie, il substrato utilizzato per la ricerca spesso non ha relazione con l’organo più colpito dalla patologia, interpretazione del dato di laboratorio è più complessa

EMA su esofago di scimmia

Le principali patologie autoimmuni sistemiche Lupus eritematoso sistemico (LES) Sclerosi sistemica(SSc) Dermatomiosite/polimiosite Sindrome di Sjogren Sindromi da sovrapposizione (overlap) MTCD Vasculiti Artrite Reumatoide Sindrome da anti fosfolipidi aaaaa

I più comuni esami disponibili per la ricerca di autoanticorpi non organo specifici Anticorpi anti nucleo (ANA) Anticorpi anti DNA nativo (dsDNA) Anticorpi anti antigeni nucleari estraibili (ENA) Anticorpi anti granulociti neutrofili (ANCA) Anticorpi anti proteine citrullinate (CCP) Anticorpi anti Istoni Anticorpi anti fosfolipidi*

Tecniche analitiche disponibili Immunofluorescenza indiretta ELISA Immunoblot RIA (Immunodiffusione) Controimmunoelettroforesi) Citofluorimetria Microarray

Immunofluorescenza indiretta Incubazione del siero, opportunamente diluito, su un substrato ricco dell’antigene bersaglio Lavaggio con tampone per eliminare gli anticorpi non specifici, quindi non legati all’antigene Incubazione con anticorpo anti immunoglobuline IgG (IgA) umane coniugato con Isotiocianato di fluoresceina Lavaggio con tampone Al microscopio a fluorescenza le strutture dove si sono formati complessi antigene anticorpo appaiono colorate in verde

IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA PER ANA Test di screening: immunofluorescenza indiretta su coltura di cellule epiteliali (Hep2) alla diluizione 1:80 Titolazione: diluizioni successive fino alla scomparsa della fluorescenza Identificazione e descrizione del tipo o “pattern” fluorescente osservato In caso di positività è opportuno procedere con esami di secondo livello: ricerca di anticorpi anti DNA , ENA Solo in rarissimi casi pazienti negativi per anti-nucleo risultano positivi per anti DNA o ENA Limite del metodo: l’esperienza dell’operatore

ANA test di primo livello Da eseguire in immunofluorescenza indiretta su cellule Hep2 Individuabili più di 30 pattern nucleari e citoplasmatici Vi è associazione significativa con alcune patologie autoimmuni Compaiono precocemente nella malattia Talvolta precedono i segni clinici Da valutare con cautela: i bassi titoli, il dato isolato Non sempre l’entità del titolo correla con l’andamento della malattia La titolazione è comunque utile per individuare altre specificità presenti

Da ricordare: anticorpi anti nucleo a basso titolo possono essere presenti In soggetti sani In gravidanza Nelle donne >40 anni Negli anziani In alcune neoplasie Nell’insufficienza renale In alcune infezioni virali (mononucleosi, AIDS)

WHO 66/233 (1:80)

L’immunofluorescenza indiretta, se effettuata in un “sistema” ben controllato consente Di individuare un gran numero di autoanticorpi nucleari e citoplasmatici Di individuare anticorpi diretti verso antigeni espressi solo in determinate fasi cellulari Di rilevare la presenza di anticorpi presenti in concentrazioni molto basse

lamine nucleari periferico

omogeneo

Granulare (speckled)

Speckled & fuso

lisosomi

ribosomi

Omogeneo+ speckled+ nuclear dots

Fuso mitotico

Anticorpi anti DNA Farr (RIA): il “gold standard”. Rileva anticorpi ad alta affinità. Indaginoso, è poco usato per motivi pratici. Immunofluorescenza indiretta (su Chritidia Luciliae). Altamente specifico, rileva anticorpi ad alta affinità. Limite: qualitativo. ELISA: sempre più utilizzato. Vantaggio: quantitativo. Limite: a volte ad un’alta sensibiltà si contrappone una minore specificità. Si possono riscontrare falsi positivi anche utilizzando antigeni ricombinanti. Immunoblot : non soddisfacente Citofluorimetria : ancora risultati scadenti Microarray: in fase di sperimentazione

ANTICORPI anti-DNA NATIVO - double stranded DNA ( test di secondo livello) Uno dei criteri diagnostici per il LES secondo l’American College of Rheumatology Prevalenza variabile nel LES dal 40 all’80%; raramente presenti ad alto titolo in altre patologie (IgG) Il titolo segue l’attività della malattia

ENA test di secondo livello Sono antigeni nucleari (proteine associate al DNA o all’RNA) o citoplasmatici La presenza di anticorpi verso uno o più di questi antigeni caratterizza il profilo sierologico della malattia Hanno notevole specificità per alcuni quadri clinici Hanno notevole significato diagnostico e prognostico Compaiono precocemente Non è necessario un risultato quantitativo (tranne semmai che per RNP): la quantità di anticorpi determinabili non correla con l’andamento della malattia

ENA metodiche disponibili Immunodiffusione doppia Controimmunoelettroforesi ELISA Immunoblot Dot blot Citofluorimetria Microarray

ENA: nessuno è perfetto ELISA: molto sensibile, a volte poco specifica. Grandi differenze qualitative tra i prodotti in commercio Immunoblot: non adatto per tutti gli antigeni (Immunodiffusione: specifica, con sensibilità buona, ma difficile da interpretare : in disuso) (Controimmmunoelettroforesi: lunga e complessa. Poco usata) Citofluorimetria, microarray: ancora da perfezionare In conclusione: l’optimum sarebbe poter utilizzare sempre due metodiche

Immunoblot Proteine estratte da cellule Hep2 vengono separate con SDS PAGE al termine dell’elettroforesi le proteine, separate in base al peso molecolare, vengono selezionate e trasferite su nitrocellulosa in base a pannelli predefiniti il siero in esame viene posto in incubazione sulle strisce pretrattate: eventuali autoanticorpi si legano agli specifici antigeni. La loro evidenziazione avviene con un siero anti-immunoglobuline umane coniugato con enzima. La reazione con il substrato evidenzia la presenza di bande, che vengono confrontate con quelle ottenute da sieri di riferimento su una striscia di controllo

I = Controllo positivo. II= Controllo negativo III= Campione positivo per SSA ed SSB

ELISA Per gli ENA esistono buoni kit in immunoenzimatica La determinazione quantitativa non è in realtà necessaria Risultati più affidabili se il coating delle piastre è fatto con l’antigene specifico piuttosto che con un pool di antigeni (ENA screening”)

Vi è notevole incertezza nel definire quale sia la modalità migliore per la preparazione degli antigeni ENA:l’utilizzo degli Ag nativi consente il mantenimento dei principali epitopi conformazionali, ma la preparazione è costosa e complessa.Quanto alle metodiche impiegate, quelle in cui l’antigene è allo stato nativo sono quelle a più bassa sensibilità e a più alta specificità.

Biochip

Citofluorimetria

Le più autorevoli associazioni operanti nel campo dell’ Autoimmunità (FIRMA, SiMeL, AMCLI..) propongono linee guida per la diagnostica autoimmune: Per raggiungere la migliore accuratezza diagnostica Per fornire al clinico informazioni precise Per inquadrare il più possibile il paziente Per limitare incertezze e dubbi in un campo in cui sovente le patologie hanno un esordio subdolo e nel contempo Per limitare gli sprechi dovuti a richieste non appropriate Per ridurre il carico economico sia sul paziente che sulla Regione in un percorso diagnostico che richiede esami spesso costosi Per utilizzare al meglio le risorse umane e tecniche Il percorso dovrebbe essere condiviso dai clinici e dagli specialisti di laboratorio

Esistono Linee guida per ANA DNA ENA ANCA ANTICORPI ANTI FOSFOLIPIDI

Esistono percorsi diagnostici suggeriti per la ricerca di autoanticorpi Nelle connettiviti sistemiche Nella celiachia Nelle vasculiti Nel diabete mellito di tipo I

Granulare atipico (PCNA) SOSPETTO di LES ? no Ab anti-nucleo presenti >1:80 LES improbabile si Pattern: Omogeneo (DNA) Periferico (DNA) Granulare (RNA) Granulare atipico (PCNA) Ab anti-DNA ENA + + SM PCNA: probabile diagnosi di LES SSA SSB RNP: associazione anche con altre patologie A titolo elevato possibile LES

LES pattern antigene specificità omogeneo/ DNA elevata periferico istoni LES da farmaci granulare RNA: Sm elevata SS-A lupus discoide SS-B, RNP granulare atipico PCNA elevata (pleomorfico) citoplasmatico proteine ribosomiali elevata denso

omogeneo

Sm?

PCNA

SCLEROSI SISTEMICA pattern antigene specificità nucleolare RNA polimerasi elevata fibrillarina granulare SS-A SS-B omogeneo e DNA topoisomerasi (SCL70) elevata nucleolare Pm/Scl centromerico centromero elevata per CREST

SINDROME DI SJÖGREN pattern antigene specificità granulare RNA: SS-A SS-B frequente **blocco cardiaco fetale nucleare atipico, puntiforme (nuclear dots) apparato mitotico

Apparato di Golgi

Nuclear dots

midbody

POLIMIOSITE - DERMATOMIOSITE pattern antigene specificità citoplasmatico tRNA sintetasi (Jo1) elevata (non presenti ANA) omogeneo e Pm/Scl nucleolare

JO1

MALATTIA MISTA DEL CONNETTIVO (MCTD) pattern antigene specificità granulare RNP presenti a concentrazione più elevata che nel LES

Seguire le linee guida Dare al paziente ed al clinico le informazioni appropriate Contenere i costi ed i tempi

ARTRITE REUMATOIDE La presenza di alcuni autoanticorpi è comune in molti pazienti con Artrite Reumatoide. Tuttavia: sono presenti a basso titolo (ANA, DNA) sono generalmente poco specifici, ad eccezione degli anticorpi anti proteine citrullinate. Se la determinazione è effettuata con test di terza generazione, la specificità risulta del 98% con una sensibilità fino al 70% l’introduzione di tali test in combinazione con il Fattore Reumatoide può essere un utile strumento per la diagnosi precoce: alcuni studi suggeriscono che la presenza di tali anticorpi sia un marcatore prognostico

Sindrome da anticorpi antifosfolipidi Sintomi- criterio: Trombosi vascolari Patologie ostetriche Test criterio: LAC Anti Cardiolipina Anti Beta 2 Glicoproteina

Criteri diagnostici LAC positivo Anti Cardiolipina IgG/IgM positivo * Anti Beta2 Glicoproteina IgG/IgM *positivo Positività ad uno dei test in due determinazioni ad almeno 3 mesi una dall’altra (*: eseguito con ELISA standardizzato; valutare con attenzione basse positività)) All’aumentare del numero di test positivi aumenta il rischio di eventi tromboembolici

VASCULITI ANCA - ASSOCIATE Granulomatosi di Wegener Sindrome di Churg-Strauss Poliangioite microscopica Gli ANCA sono generalmente assenti in alcune vasculiti primarie dei vasi di medio e grosso calibro: poliarterite nodosa, arterite temporale, arterite di Kawasaki, Takayasu, malattia di Bechet. In presenza di manifestazioni cliniche che suggeriscono la diagnosi, il riscontro di ANCA ha elevata sensibilità (>80%) e specificità (>95%)

ANCA metodiche disponibili Immunofluorescenza indiretta su granulociti umani fissati in etanolo ELISA (PR3)= fluorescenza citoplasmatica (c ANCA) ELISA (MPO)= fluorescenza perinucleare (p ANCA) Immunofluorescenza indiretta su granulociti fissati in formalina

Per una corretta diagnostica degli ANCA Screening su granulociti fissati in etanolo Per i positivi (sia con pattern citoplasmatico che perinucleare) a) ELISA (proteinasi 3, mieloperossidasi) b)Immunofluorescenza indiretta su granulociti fissati in formalina. I positivi presentano sempre fluorescenza citoplasmatica

VASCULITI ANCA ASSOCIATE pattern principale antigene perinucleare / nucleare MPO (mieloperossidasi) citoplasmatico PR3 (proteinasi 3)