Sistema NF-kB e sua modulazione a fini terapeutici nelle neoplasie solide ed ematologiche Anna Marina Liberati Lorenzo Falchi Federica Di Costanzo Giorgia Desantis Paola Cerroni Annamaria Rauco

Modulazione del sistema NF-kB nella strategia terapeutica delle neoplasie Perché ?

Modulazione del sistema NF-kB nella strategia terapeutica delle neoplasie Attivazione NF-kB Alterazioni genetiche dei vari componenti del sistema Meccanismi diversi in assenza di mutazioni dirette nei geni di questa via Neoplasie ematologiche Neoplasie solide

Ambiente extra e cellulare NF-KB compartimenti intracellulari NIK: NF-kB inducing kinase MEKK1: mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase kinase1 IRAK:interleukin-1 receptor associated kinase TRAF:tumour necrosis factor alpha receptor associated factors PKC:protein kinase C

Sistema NF-kB È un sistema complesso Cerchiamo di renderlo semplice

Sistema NF-kB Parte centrale funzionalmente attiva (vari dimeri) se raggiunge il nucleo –DNA Molecole inibitorie-regolatorie-IkB bloccano il passaggio nel nucleo A+B sono legate in un unico complesso Dimeri interattivi con DNA IkB Fosforilazione IkB

IKK Sistema NF-kB Stimoli esterni: Funzionalmente complesso ed attivato da sistemi complessi Ma cerchiamo di rendere il tutto più semplice Stimoli esterni: Molecole ad attività chinasica –IKK Fosforilazione di IkB rende possibile il legame con ubiquitina  Degradazione di IkB  B si stacca da A A migra nel nucleo a svolgere il suo lavoro, NF-kB IKK Attivazione di varie vie di trasduzione del segnale che attivano IKK

Sistema NF-kB È un sistema complesso Cerchiamo di renderlo semplice

Ogni parte del sistema è formato da proteine Esame del sistema Sistema NF-kB Ogni parte del sistema è formato da proteine con funzioni diverse  +/- Dimeri interattivi con DNA

Sistema NF-kB + = c Rel; Rel A/p65; Rel B / - = p 50 (NFkB1) e p52 (NFkB2) Parte centrale dimeri P50/P65 (NF-kB) P50(NF-kB1) P50/c-rel P52 (NF-kB2) P65/P65 P65/c rel  trascrizione  trascrizione

B. Complesso centrale : molecole regolatorie IKB Sistema NF-kB B. Complesso centrale : molecole regolatorie IKB Funzione - IkB, IkB, IkB, IkB Citoplasma IkB Dimeri interattivi con DNA Funzione + Bcl-3  nucleo Bcl-3

Sistema NF-kB C. Molecole ad attività chinasica IKK Funzione + catalitica IKK  e IKK  Funzione + di reclutamento (delle chinasi che fosforilano il sist. IKK , , ) IKK  Funzione – regolatrice IKK  (NEMO)

Citochine, ROS, Tat, Tax, LPS… MEMBRANA PLASMATICA TAK, PKC, PKR, Cot… CITOPLASMA Akt, NIK, MAPKKK    IKK P NF-kB IkB p65 p50 IkB p65 p50 molecole di adesione Bcl-xL, c-IAP citochine Cox-2, iNOS ciclina D1… Β-catenina, cicline, Vpu SCF-β-TrCP antigeni, p53 cicline UB PROTEOSOMA IkB p65 p50 p65 p50 IkB UB p65 p50 NUCLEO IkB UB

ATP + E1 + + Ubiquitina E2 + E3 Target +

Citochine, ROS, Tat, Tax, LPS… antigeni, p53 cicline NF-kB IkB UB MEMBRANA PLASMATICA Citochine, ROS, Tat, Tax, LPS… CITOPLASMA    IKK PROTEOSOMA SCF-β-TrCP Β-catenina, cicline, Vpu TAK, PKC, PKR, Cot… Akt, NIK, MAPKKK P molecole di adesione Bcl-xL, c-IAP citochine Cox-2, iNOS ciclina D1… p65 p50 NUCLEO

Ruolo di NF-kB nella vita cellulare SOPRAVVIVENZA CELLULARE E’ FACILITATA Trascrizione di geni Enzimi di risposta allo stress Molecole direttamente coinvolte nel ciclo cellulare Molecole di adesione Proteine anti-apoptotiche Bcl-2, cIaP1, cIaP2 Citochine pro-infiammatorie

NF-kB-APOPTOSI Proteine anti-apoptotiche Bcl-2, cIaP1, cIaP2

VIA ESTRINSECA E INTRINSECA DELL’APOPTOSI INIBITE DA NF-KB Fas, FasL Bax, Noxa, pig3 CASPASI-8 NF-kB MITOCONDRIO Bcl-x, Bcl-2 Diabo/Smac cIAPs, XIAP Cit. C AIF CASPASI-3,7 CASPASI-9 APOPTOSI Apaf1 VIA INTRINSECA VIA ESTRINSECA

NF-kB-CICLO CELLULARE direttamente coinvolte Molecole direttamente coinvolte nel ciclo cellulare

x NF-kB NF-kB e regolazione del ciclo cellulare G1 M S G1 G2 CDC25 P p21waf1 GADD45 CICLINA D CDK4/6 CICLINA B CDC2 G1 x M S G1 G2 Chk1 e 2 CDC25 P

Ruolo di NF-kB nella regolazione del ciclo cellulare Prove indirette: Il ruolo critico di NF-kB nel controllo del ciclo cellulare è dimostrato indirettamente attività NF-kB nella transizione G0-G1 livelli di NF-kB “attivato” correlano con i segnali che controllano il ciclo cellulare inibizione di NF-kB “attivato” determina un ritardo nella transizione G1-S

Ruolo di NF-kB nella regolazione del ciclo cellulare Prove dirette: siti di legame di NF-kB nella regione “promoter” del gene che codifica per la ciclina D1 ciclina D1 e ciclinochinasi (CDK4 e CDK6) G1  S attraverso la fosforilazione CDK-dipendente di pRb liberazione di E2F attivazione geni S-fase specifici

Linfomi  NK-kB Varie componenti (una o più) del sistema sono danneggiate Come conseguenza di 1 si può realizzare o non attivazione costitutiva nucleare di NF-kB Attivazione di NF-kB si può realizzare anche attraverso altre vie

Ruolo di c-rel nell’oncogenesi Modelli animali  oncogenicità acuta del derivativo virale (oncoproteina v-Rel) 2. Amplificazione del gene umano c-rel  23% DLCL  75-85% presentazioni extranodali DLCL  forma primitiva del mediastino  alcune forme di L.follicolari (LF) 3. Riarrangiamento del gene umano c-rel  alcuni (pochi) casi di LF ed alcuni DLCL

Ruolo di c-rel nell’oncogenesi proteina ibrida “c-rel Nrg” DLCL (dominio N terminale RH di c-rel + sequenze di geni non correlati) transattivazione del dominio C-terminale vantaggio selettivo di crescita induzione linfomi in modelli animali associazione con forme clinicamente avanzate di DLCL

Ruolo di Rel-A nell’oncogenesi Alterazioni cromosomiche coinvolgenti Rel-A (11q-13) relativamente infrequenti Sporadiche traslocazioni cromosomiche coinvolgenti il gene Rel-A in LNH e MM Amplificazione di Rel-A in sporadici casi di DLCL

Ruolo di NF-kB1 nell’oncogenesi Rare alterazioni (strutturali e di espressione) del gene NF-kB1 (4q24) sono presenti nelle leucemie e nei linfomi

Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi Traslocazioni e delezioni di nf-kb2(10p24) sono frequenti in diversi tipi di linfomi B e T cellulari Traslocazioni o delezioni di nf-kb2 produzione di una p100 “troncata” con parziale delezione del dominio C-terminale Fusione in alcuni casi con sequenze eterologhe

Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi La conseguenza funzionale della traslocazione o delezione è localizzazione nucleare “constitutiva” della p100 “troncata” e suo legame ai “KB-DNA motifs”senza formazione della p52 matura

Ruolo di NF-kB1 nell’oncogenesi Rare alterazioni (strutturali e di espressione) del gene NF-kB1 (4q24) sono presenti nelle leucemie e nei linfomi

Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi Traslocazioni e delezioni di nf-kb2(10p24) sono frequenti in diversi tipi di linfomi B e T cellulari Traslocazioni o delezioni di nf-kb2 produzione di una p100 “troncata” con parziale delezione del dominio C-terminale Fusione in alcuni casi con sequenze eterologhe

Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi La conseguenza funzionale della traslocazione o delezione è localizzazione nucleare “constitutiva” della p100 “troncata” e suo legame ai “KB-DNA motifs”senza formazione della p52 matura

Ruolo di NF-kB2 nell’oncogenesi Modello proposto: p100 tumorali  alterazione della trascrizione NF-kB mediata p100 “troncata” attiva “da sola”la trascrizione genica p100 “troncata”  agisce come transattivatore costitutivo

Ruolo di Bcl-3 nell’oncogenesi • Proteina Bcl-3 strutturalmente correlata alla famiglia dei regolatori IkB di Rel/NF-KB •• Bcl-3 è presente nel nucleo ove interagisce con omodimeri di p50 e p52 alterandone la loro attività DNA legante e modulando l’espressione genica ••• Bcl-3 favorisce la trascrizione NF-kB mediata rimuovendo dal DNA omodimeri p50 inattivi •••• Bcl-3 agisce come co-attivatore per omodimeri p52

Ruolo di Bcl-3 nell’oncogenesi • Il gene bcl-3(19q 13.1) è coinvolto in una rara, ma ricorrente traslocazione t(14;19) (q32.3;q13.2) riscontrata nella LLC-B •• Le traslocazioni che coinvolgono bcl-3 determinano una iper-espressione della normale proteina Bcl-3 ••• Iper-espressione di Bcl-3  “step” critico nel modello multisteps che determina la trasformazione cellulare

Ruolo della inattivazione di IkB nell’oncogenesi • IkB  inibitore di NF-kB •• Iper-espressione antisenso di trascritti Ikb  trasformazione di cellule murine NIH₃ ••• Ridotta attività di IkB correla persistente localizzazione nucleare di NF-kB e suo legame con il DNA ed attività transattivante

Ruolo della inattivazione di IkB nell’oncogenesi Linfoma di Hodgkin IkB = “tumor-suppressor” Gene ikb : localizzato sul cromosoma 14q13 Nel LH sono presenti mutazioni inattivanti in ikb e/o ikb con deregolazione funzionale del complesso NF-kB/IkB e conseguente attivazione di NF-KB. Nel LH esiste una correlazione inversa tra i livelli delle proteine IkB e IkB e l’attivazione di chinasi IkB (IKK) Sebbene la regione cromosomica 14q13 non sia frequentemente coinvolta in riarrangiamenti o delezioni cromosomiche nel LH, non si può escludere che mutazioni non identificate siano presenti in molti casi di questa malattia.

Modulazione del sistema NF-kB nella strategia terapeutica delle neoplasie Alterazioni genetiche dei vari componenti del sistema Meccanismi diversi in assenza di mutazioni dirette nei geni di questa via Attivazione NF-kB Neoplasie ematologiche

Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfoma di Hodgkin: L’attivazione persistente di NF-kB è critica per Proliferazione Resistenza ad apoptosi Formazione di tumori c. RS in topi SCID Rilevanza patogenetica di NF-kB nel LH

Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfoma di Hodgkin: Attivazione NF-kB: diretta conseguenza di mutazioni dei geni IkB  (IkB) proteine IkB non funzionali per mancanza di varie porzioni del dominio centrale anKyrin e delle regioni C- terminali

Attivazione autocrina citochina-mediata da parte delle cellule di RS Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfoma di Hodgkin: Attivazione persistente della via di trasduzione del segnale Proteolisi di IkB Attivazione autocrina citochina-mediata da parte delle cellule di RS Altri meccanismi anche correlati alla infezione da EBV

↑ proteine coinvolte in: Meccanismi che determinano la costitutiva attività di NF-kB Mutazioni di IkBε Mutazioni di IkBα LMP1 Permanente attivaz. delle IKK (resistenza alle fosfatasi) Overespress.CD30 ed altri TNFR NF-kB ↑ “network” genico di tipo antiapoptotico: ciclina D2, CD40, CD86. reclutamento background cellulare; localizzazione zona interfollicolare; deregolazione proliferazione. ↑ proteine coinvolte in:

Attivazione NF-kB Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfoma mantellare: Interazione tra CD 154 ectopica e CD40 ancorato Attivazione NF-kB  Cicline D1 per traslocazione t(11;14) gene target di NF-kB

Attività costitutiva nucleare di NF-kB Linfomi MALT e B-CLL: Del 10 t (1;14)  attivazione NF-kB Citochine  attivazione NF-kB

Attività costitutiva nucleare di NF-kB ATL: Meccanismo TAX-dipendente Proteina TAX del HTLV-1  Attivazione IKK chinasi Attivazione NF-kB Meccanismo TAX-indipendente Degradazione di IkB

Attività costitutiva nucleare di NF-kB DLCL: Attivazione costitutiva di IKK chinasi Localizzazione nucleare NF-kB

Modulazione dell’attività di NF-kB Agenti che regolano l’espressione delle proteine NF-KB ed il loro legame al DNA: molecole antisenso composti “NF-kB-decay” nibitori RNA Agenti che interferiscono con la formazione del complesso IKK: “NEMO binding-domain peptide” Agenti che bloccano il complesso di attivazione IKKB: “Toll-IL-1 receptor adapter protein peptide” Inibitori “heat-shock protein 90” Inibitori del proteosoma Inibitori dell’attività trascrizionale inclusi i glucocorticoidi

Omeostasi proteica e proteosoma •Omeostasi proteica è critica nei processi biologici fondamentali per la sopravvivenza cellulare ••Particolarmente rilevante è la modulazione dell’omeostasi di quelle proteine critiche nella regolazione del ciclo cellulare •••La via ubiquitina-proteosoma (UPP) è il principale meccanismo di degradazione delle proteine,comprese quelle coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. ••••Proteosoma è un bersaglio pertanto rilevante nella terapia biologica “mirata” delle neoplasie.

PROTEOSOMA SUBSTRATI DIVISIONE CELLULARE Topoisomerasi II svolgimento DNA Topoisomerasi I svolgimento DNA FATTORI PRO- E ANTI-APOPTOTICI ONCOSOPPRESSORI XIAP anti-apoptotico Bax pro-apoptotico Bcl2 anti-apoptotico Survivina anti-apoptotico Securina promozione anafase P53 fattore di trascrizione RB inibitore di E2F REGOLATORI TRASCRIZIONALI PROGRESSIONE CICLO Ciclina E attivatore chinasi p27 KIP1 inibitore CDK p27 CIP1/WAF1 inibitore CDK Rec androgeni rec nucleari; fattore di trascrizione Fos/Jun fattori di trascrizione Id inibitore fattore di trascrizione ikB-α inibitore di NF-kB

A schematic of the 26S proteasome b 19S

Inibitori del proteosoma Cinque classi diverse Solo la classe peptide-boronato ha caratteristiche che la rendono clinicamente utile Utilità clinica Caratteristiche Stabilità metabolica, attività enzimatica, reversibilità del legame

Inibitori del proteosoma Meccanismo d’azione Acidi peptide boronico inibiscono le serine proteasi come la chemotripsina-imitando il substrato nel legame nel sito attivo. Queste molecole possono inibire il proteosoma legandosi al sito chemotripsina-simile della parte centrale 20S

Cross-sectional view of the bortezomib binding site in the proteasome Post-glutamyl Tryptic 7 3 Bortezomib 6 4 Chymo-tryptic

Inibitori del proteosoma Effetti biologici APOPTOSI PROLIFERAZIONE MIGRAZIONE p53 Bid Bax p21 p27 Caveolina 1 STABILIZZAZIONE APOPTOSI APOPTOSI JNK NF-kB ANGIOGENESI PROLIFERAZIONE PROTEOSOMA

Inibitori del proteosoma Effetti biologici • Proteosoma degrada numerose proteine ••Inibizione UPP determina una modulazione- alterazione di diversi “momenti”della vita cellulare •••L’attività del bortezomid si realizza nella modulazione dei meccanismi e vie molecolari multiple e diverse ••••L’effetto finale del bortezomid, in differenti genotipi-fenotipi cellulari neoplastici è pertanto espressione della sua azione “preferenziale”su alcune vie molecolari patogeneticamente critiche

Conclusioni Esiste il razionale patogenetico per l’uso degli inibitori del sistema NF-kB nelle malattie linfoproliferative Attuale iniziale provata efficacia clinica del Velcade nella terapia delle malattie linfoproliferative