Misure con biomarcatori II. Enzimologia Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © by Giorgio Sartor. All rights reserved. Versione gennaio 2006

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II2 Spontaneità Una qualunque reazione chimica avviene spontaneamente se e solo se la variazione di energia libera (G) è negativa: G T,p < 0 G T = H – TS A T e p costanti

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II3 Spontaneità Quindi, data una qualunque reazione chimica A B Essa avviene spontaneamente se le energie libere molari G B < G A Più in generale qualunque trasformazione avviene se e solo se: G finale < G iniziale

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II4 Spontaneità ed equilibrio Quando G B = G A Quindi G = 0 La reazione è allequilibrio

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II5 Spontaneità e realtà Questo non significa che una reazione chimica (un processo) esoergonica (G < 0) avvenga con velocità apprezzabile. G° = -7.3 kcal·mole -1 (-30.6 kJ·mole -1 ) a pH 7 G° = -10 kcal·mole -1 (-42 kJ·mole -1 ) a pH 9 ATP + H 2 O ADP + Pi

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II6 Energia di attivazione In soluzione lATP è stabile perché esiste lenergia di attivazione.

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II7 Catalisi In assenza di catalizzatore: A + B C + D

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II8 Catalisi

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II9 Catalisi In presenza di catalizzatore: A + K AK AK + B ABK ABK C + D + K

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II10 Catalisi

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II11 Controllo termodinamica e controllo cinetico di una reazione Ogni reazione può avvenire se e solo se è termodinamicamente favorita (G < 0), Avviene se e solo se vi è abbastanza energia per superare lenergia di attivazione: H H 2 O + ½ O 2 Catalizzatore: –Nessuno H* = 18 kcal·mole -1 –Platino H* = 11.7 kcal·mole -1 –Catalasi H* = 5.5 kcal·mole -1

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II12 In una reazione chimica A B v = k · [A]

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II13 In una reazione enzimatica

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II14 Enzimi Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere… … proteine

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II15 Enzimi Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere… … proteine

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II16 Specificità degli enzimi Specificità –Stereochimica –Assoluta –Di gruppo –Di legame

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II17 Specificità degli enzimi Specificità stereochimica

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II18 Specificità degli enzimi Specificità assoluta

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II19 Specificità degli enzimi Specificità di gruppo –Proteasi …-Leu-Arg-Gly-Phe-… Taglia qui

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II20 Specificità degli enzimi Specificità di legame –Esterasi Estere Acido + Alcool

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II21 Classificazione degli enzimi Singolo enzima –Ureasi Complesso enzimatico –Complesso piruvato deidrogenasi

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II22 Classificazione gerarchica degli enzimi Ogni enzima viene classificato a secondo della reazione che catalizza. Viene classificato con un numero: EC X.Y.Z.T X = classe Y = sottoclasse Z = sotto-sottoclasse T = numero dellenzima nella sotto-sottoclasse – –

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II23 Classificazione gerarchica degli enzimi Classi: –1. Ossidoreduttasi Catalizzano una reazione redox. –2. Transferasi Catalizzano il trasferimento di un gruppo da una molecola ad unaltra: X-Y + Z X-Z + Y le chinasi trasferiscono un gruppo fosfato. –3. Idrolasi Catalizzano la scissione idrolitica di legami C=O, C-N, C-C, P-O-P,…

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II24 Classificazione gerarchica degli enzimi Classi: –4. Liasi Catalizzano scissioni di legami con meccanismi diversi dalle Ossidoreduttasi e dalle Idrolasi. –5. Isomerasi Catalizzano modificazioni geometriche. –6. Ligasi (Sintetasi) Catalizzano lunione di due molecole accoppiata al consumo di ATOP o di un altro nucleotide trifosfato.

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II25 Classificazione gerarchica degli enzimi Per esempio: Alcool + NAD + Aldeide o chetone + NADH Nome comune: alcool deidrogenasi Nome sistematico: alcool:NAD + ossidoreduttasi EC La classe - Ossidoreduttasi La sottoclasse – Agiscono sul gruppo di donatori CH-OH La sotto-sottoclasse – con NAD + o NADP + come accettori Numero dellenzima nella sotto-sottoclasse

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II26 Isoenzimi Questa classificazione NON riguarda gli enzimi in quanto proteine ma in quanto CATALIZZATORI La classificazione riguarda quindi gli enziomi che catalizzano una reazione. Proteine diverse (con diversa struttura primaria) che catalizzano la stessa reazione, sono ISOENZIMI

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II27 Isoenzimi Sono le forme multiple dovute a differenze, determinate geneticamente, di struttura primaria Sono anche isoenzimi quelle proteine che svolgono la stessa funzione ma sono geneticamente indipendenti, per esempio: EC malato deidrogenasi –Citosolica (codificata dal DNA nucleare) –Mitocondriale (codificata dal DNA mitocondriale)

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II28 Cenni di cinetica chimica Allequilibrio v 1 = v -1

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II29 Cenni di cinetica chimica Ordine di reazione –I ordine v 1 = k 1 [A] –II ordine v 1 = k 1 [A] 2 oppure v 1 = k 1 [A][B] I ordine rispetto ad A I ordine rispetto a B II ordine globale –Ordine 0 v 1 = k 1 indipendente dalla concentrazione dei reagenti

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II30 Dipendenza dalla temperatura La velocità di una reazione dipende dalla temperatura attraverso la costante di velocità k Allequilibrio

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II31 Dipendenza dalla temperatura

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II32 Dipendenza dalla temperatura

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II33 Dipendenza dalla temperatura Allequilibrio

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II34 Enzima e substrato In una reazione tra enzima (E) e substrato (S), possiamo distinguere tre fasi: 1.Legame tra E e S per formare il complesso ES E + S ES [E]>>[S] Stato prestazionario 2. Stato stazionario 3.Scompare il substrato, [ES] diminuisce, v diminuisce

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II35 Enzima e substrato tempo Concentrazione 1 a fase Stato prestazionario 2 a fase Stato stazionario 3 a fase Fine d[P]/dt cost. Prodotto ES d[P]/dt = cost. d[ES]/dt = 0

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II36 Enzima e substrato In una reazione enzimatica lordine di reazione è variabile

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II37 Enzima e substrato In una reazione enzimatica lordine di reazione è variabile [S] Velocità [S] Velocità Ordine 1Ordine 0

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II38 Trattamento secondo Michaelis e Menten In una reazione enzimatica: Per lequilibrio veloce (1) INDETERMINABILE

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II39 Trattamento secondo Michaelis e Menten Per lequilibrio veloce (1) [E tot ] misurabile [E tot ] = [E] + [ES] INDETERMINABILE

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II40 Trattamento secondo Michaelis e Menten Da cui Costante di dissociazione del complesso ES Costante di Michaelis e Menten

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II41 Trattamento secondo Michaelis e Menten La concentrazione del complesso ES Poiché: v diretta = k 2 [ES]

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II42 Trattamento secondo Michaelis e Menten Quando tutto E tot diventa ES allora la velocità sarà massima. V max = k 2 [E tot ] Quando il substrato satura lenzima allora la velocità sarà massima

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II43 Equazione di Michaelis e Menten

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II44 Efficienza catalitica o numero di turnover k 2 è detta anche k cat e si ottiene: k 2 è detto anche numero di turnover (Moli di substrato consumate per secondo per moli di enzima) si esprime in s -1. ~1 s -1 < k 2 < 10 6 s -1

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II45 Trattamento secondo Michaelis e Menten Bassa concentrazione (relativamente) di substrato: [S]<<K M (Ordine 1) Alta concentrazione di substrato: [S]>>K M (Ordine 0)

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II46 Trattamento secondo Briggs-Haldane Da un punto di vista formale il trattamento è lo stesso di M.M., cambia il significato cinetico di K M Allo stato stazionario:

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II47 Significato di K M K M è una concentrazione: È la concentrazione di substrato al quale la velocità della reazione è metà della V max

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II48 Significato di V max V max è legata a k 2 V max = k 2 [E tot ]

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II49 Significato di K M e V max

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II50 Linearizzazione dellequazione di Michaelis e Menten

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II51 Lineweaver-Burk Inversione

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II52 Lineweaver-Burk 1/[S] 1/v 1/V max -1/K M 0 Pendenza = K M /V max

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II53 Eadie-Hofstee Trasformazione v v/[s] V max /K M Pendenza = - 1/K M V max

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II54 Eadie-Hofstee (oppure) Trasformazione v v/[s] V max /K M Pendenza = - K M V max

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II55 Reazioni enzimatiche con più substrati Meccanismo sequenziale: i substrati si legano in modo sequenziale: Prima uno poi laltro in ordine preciso: –Meccanismo sequenziale ordinato Senza un ordine preciso: –Meccanismo sequenziale casuale Meccanismo a ping-pong

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II56 Meccanismo sequenziale ordinato

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II57 Meccanismo sequenziale casuale

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II58 Meccanismo a ping-pong

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II59 Meccanismo a ping-pong Così funziona lesochinasi

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II60 Reazioni enzimatiche con più substrati Il trattamento è complesso, occorre fare lo studio cinetico tenedo fissa la concentrazione di uno dei substrati (B) variando laltro (A), così, di grafici di Lineweaver-Burk si può avere una descrizione del meccanismo: 1/[A] 1/v [B] Sequenziale casualePing-pong

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II61 Regolazione dellattività enzimatica I fattori che regolano lattività enzimatica sono: –Temperatura Enzimi solubili o di membrana –pH –Effettori Inibitori (inattivatori) Attivatori Effetti allosterici –Concentrazione di substrati e prodotti Vie metaboliche –Repressione o induzione genica

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II62 Temperatura La velocità delle reazioni chimiche dipende dalla temperatura. La stabilità di una proteina dipende dalla temperatura. Temperatura Velocità optimum Aumento cineticoDenaturazione

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II63 Temperatura La temperatura influenza la fluidità di membrana Ln v Temperatura bassa 1/T Ln v Temperatura bassa Temperatura alta Temperatura alta Temperatura di transizione della fase lipidica Enzima solubileEnzima di membrana

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II64 pH La stabilità di una proteina dipende dal pH. Alcuni processi coinvolgono valori estremi di pH Velocità relativa pH TripsinaPepsinaAceticolinesterasi 2610

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II65 Effettori Attivatori Inibitori La differenza non è netta, la stessa molecola può funzionare in entrambi i modi a seconda delle condizioni –Carica –Concentrazione –Enzima legato ad altre molecole –…

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II66 Inibitori Si definiscono inibitori quelle molecole che diminuiscono lattività di un enzima, possono dare Inibizione reversibile –Modificano in modo reversibile (in genere attraverso un legame non covalente) lenzima Inibizione irreversibile –Modificano in modo irreversibile lenzima

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II67 Inibitori reversibili A secondo delle loro caratteristiche si definiscono: –Inibitori competitivi –Inibitori non competitivi –Inibitori acompetitivi

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II68 Inibitori competitivi Agiscono competendo con il substrato per lo stesso sito di legame, agiscono quindi sulla formazione del complesso ES. Linibizione è rimossa aumentando la concentrazione di S

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II69 Inibitori competitivi Senza inibitore Con inibitore

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II70 Inibitori competitivi Senza inibitore Con inibitore

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II71 Inibitori competitivi Sono molecole simili al substrato Occupano lo stesso sito di legame

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II72 Inibitori non competitivi Agiscono legandosi in un sito diverso dal sito di legame del substrato il quale può comunque legarsi. Linibizione NON è rimossa aumentando la concentrazione di S

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II73 Inibitori non competitivi Senza inibitore Con inibitore

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II74 Inibitori non competitivi Senza inibitore Con inibitore

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II75 Inibitori non competitivi Sono molecole diverse dal substrato, si legano ad un proprio sito Ioni metallici (Cu ++ ) Complessanti (EDTA) Modulatori

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II76 Inibitori acompetitivi Agiscono legandosi e bloccando il complesso enzima-substrato.

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II77 Inibitori acompetitivi Senza inibitore Con inibitore

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II78 Inibitori acompetitivi Senza inibitore Con inibitore

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II79 Riassumendo… Inibizione competitiva Inibizione non competitiva Inibizione acompetitiva

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II80 …riassumendo Tipo di inibizioneV MAX app K M app NessunaV MAX KMKM CompetitivaV MAX aK M Non competitivaV MAX /aaK M /a AcompetitivaV MAX /aK M /a

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II81 Inibitori irreversibili InibitoreFormulaOrigineMeccanismo Ione cianuroCN - Mandorle amare Complessa gli ioni metallici nelle proteine Diisopropil fluorofosfato (DFP) Sintetico Inibisce gli enzimi con serina nel sito attivo SarinSinteticoCome il DFP Fisostigmina Frutto del calabar Come il DFP

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II82 Inibitori irreversibili InibitoreFormulaOrigineMeccanismo ParathionSintetico Come il DFP (particolarmente attivo su acetilcolinesterasi di insetti) N-tosil-L- fenilalanina clorometil chetone (TPCK) Sintetico Reagisce con lHis-57 della chimotripsina Penicillina Penicillum Notatum Inibisce gli enzimi della sintesi della parete batterica

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II83 Attivatori Sono molecole che aumentano (o permettono) lattività enzimatica –Protezione dellenzima Glutatione Ioni metallici –Attivazione per azione sulle subunità –Azione proteolitica su proenzimi Enzima inattivo + cAMP Subunità + Subunità cataliticaregolatrice

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II84 Attivatori Azione proteolitica su proenzimi

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II85 Effetti allosterici Gli effetti allosterici consistono nel legame di un effettore ad un sito diverso da quello del substrato con conseguente variazione delle proprietà dellenzima Sono presenti soprattutto in enzimi multimerici Leffettore può essere lo stesso substrato (effettori omotropici) o diverso (effettori eterotropici) Sito attivo Sito delleffettore

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II86 Effetti allosterici Il legame con leffettore modifica (modula) le proprietà di legame del substrato. La velocità dipende da [S] come una sigmoide. n = indice di cooperatività

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II87 Vie metaboliche Una via metabolica è data da un insieme di reazioni catalizzate da enzimi che si susseguono luna allaltra. Le vie metaboliche sono regolate: Inibizione da prodotto Attivazione da substrato Attivazione compensatoria

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II88 Vie metaboliche ramificate Inibizione multivalente Inibizione cooperativa

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II89 Vie metaboliche ramificate Inibizione cumulativa Inibizione di enzimi multipli

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II90 Regolazione genica Unaltra via con la quale viene regolata lattività di uno o più enzimi è attraverso linduzione o la repressione della sintesi proteica di di quel particolare enzima. Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi.

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II91 Referenze sul WEB … Vie metaboliche –KEGG: Degradazione degli xenobiotici: Struttura delle proteine: –Protein data bank (Brookhaven): –Hexpasy Expert Protein Analysis System: Prosite (protein families and domains): Enzyme (Enzyme nomenclature database): –Scop (famiglie strutturali): Enzimi: –Nomenclatura - IUBMB: –Proprietà - Brenda: –Expasy (Enzyme nomenclature database): Database di biocatalisi e biodegradazione: Citocromo P450: Metallotioneine: Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry

gs © ver 3.0Misure con biomarcatori II92 …e naturalmente Questo ed altro materiale può essere trovato visitando il sito: Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto lautore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor Università di Bologna a Ravenna Corso di Laurea in Scienze Ambientali