I materiali biologici per l’esame colturale: tipologia ed importanza di un corretto prelievo Diagnostica Microbiologica delle Infezioni delle Basse Vie Respiratorie Firenze, 13 Marzo 2007 A. Raglio, A Grigis A.O. Ospedali Riuniti di Bergamo U.O. Microbiologia e Virologia Direttore Dott A. Goglio

I temi Il problema Il nemico L’importanza di un corretto prelievo I materiali biologici Criteri di idoneità

IL PROBLEMA La polmonite acuta è fra le prime sei cause di morte ed è la più comune causa di mortalità correlata a infezione (Mandell 99) Tanti quadri clinici Tanti patogeni Tanti materiali biologici Poche diagnosi Solo nel 20-50% delle polmoniti comunitarie si riesce a raggiungere una diagnosi eziologica Mancanza di: - standardizzazione - test di riferimento (gold standard)

CAP: Principali patogeni isolati in corso di differenti studi di sorveglianza 60 S. pneumoniae H. influenzae 50 Legionella 40 Gram negativi nessun patogeno % 30 20 10 Rello 1996 Moine 1994 Feldman 1995 28/01

IL NEMICO 28 Batteri 28 Virus 10 Funghi 2 Rickettsie 5 Mycoplasmi e Chlamydie 5 Parassiti Mandell, Infectious Diseases, Fourth Edition

I microbi del cavo orale - Flora endogena del cavo orale: 10 15 1. 0. 0. 0. 0.

Flora naso-orofaringea Opportunisti (raramente patogeni) - Str. - emolitici - S.coag.negativi - neisseriacee - Candide - Haemophilus spp - Actinobacillus spp - Anaerobi -………... Normalmente non presenti: - BGN (ferm. e non) - Enterococchi -……. Ma nei pz intubati sì

Flora naso-orofaringea Patogeni (stato di portatore sano) - S. aureus 35-40 % - N. meningitidis 5-15 % - S. pneumoniae 0-50 % - Haemophilus influenzae 5-20 % -………...

Infezioni comunitarie Infanti-bambini: -> 80% virali: Influenza, RSV, adenovirus,….. - altre: Haemophilus, S. pneumoniae, S.aureus Adulti giovani: -> batteriche: M. pneumoniae Adulti e anziani: - < 10-20% virali - altre: S. pneumoniae, Haemophilus, S.aureus e BGN fermentanti e non

Polmonite ospedaliera o nosocomiale - La seconda I.O. per frequenza (27% di tutte le I.O.in TI) - Prevalentemente batterica - S. aureus (MSSA) - S. pneumoniae, H. influenzae ------------------------ - Enterobatteri - Bacilli GN non fermentanti - S. aureus (MRSA) - Elevata mortalità

VAP: agenti eziologici in base al tempo CDC Draft 2002 Early Onset Pneumonia EOP E.coli Klebsiella spp Proteus spp S.pneumoniae H.influenzae MSSA Late Onset Pneumonia LOP P.aeruginosa BGN con ESBL MRSA Acinetobacter spp ………. NON Multi R Spesso Multi R

Immunodepressi per patologia di base - Fibrosi cistica: - P. aeruginosa (spesso mucoso) - Alcaligenes spp - B. cepacia - S. maltophilia - S. aureus - H. influenzae (anche non b) e S.pneumoniae - Aspergillus - Micobatteri spp E’ dovuta ad un difetto del gene che regola la conducibilità transmembrana del trasporto degli ioni e dell’acqua attraverso l’epitelio. Si manifesta già in bambini piccoli che mostrano spesso diarrea e non crescono. Sono germi spesso multiresistenti perché sono soggetti sottoposti spesso a terapia antibiotica B.cepacia è causa della “sindrome da B.cepacia “ fulminante e spesso con sepsi.

Il nemico Occorre conoscerne: la patogenicità e i meccanismi di virulenza le caratteristiche colturali (esigenze nutritive, l’atmosfera di crescita, i tempi di crescita) e la carica per distinguerlo fra la flora contaminante i determinanti antigenici le sequenze identificative le sensibilità ad antibiotici e disinfettanti

L’importanza di un prelievo corretto oppure meglio: L’importanza di una interpretazione corretta in base al prelievo

Contributo della microbiologia Diversamente da altre indagini strumentali e di laboratorio, la richiesta di indagini microbiologiche presenta aspetti peculiari: il tipo e la qualità del campione condizionano in modo assoluto i risultati dell'indagine microbiologica, l'invio del campione al microbiologo sottintende la domanda: "C'è qualcosa nel campione che può contribuire alla diagnosi ed alla terapia della malattia infettiva?"; ciò equivarrebbe ad inviare al Laboratorio di chimica clinica un campione di sangue "per ricerca di anormalità chimiche", senza ulteriore indicazione o precisazione

Contributo della microbiologia Garbage in Garbage out

Il Manuale di raccolta PRELIEVO, CONSERVAZIONE ED INVIO DEI CAMPIONI M&V Ospedali Riuniti di Bergamo PRELIEVO, CONSERVAZIONE ED INVIO DEI CAMPIONI PER INDAGINI MICROBIOLOGICHE 3a ed., maggio 2001, pag. 114 www.ospedaliriuniti.bergamo.it Altri Manuali consultabili al sito: www.apsi.it

Iter dell’indagine microbiologica

Polmoniti Campioni per la diagnosi eziologica Materiali raccolti con metodiche protette, a bassa contaminazione Lavaggio bronco-alveolare (BAL) Lavaggio bronco-alveolare mirato con cateterino Spazzolatura endobronchiale protetta (PSB) Materiali ad alto rischio di contaminazione con saliva Espettorato (o espettorato indotto o indotto-protetto) Aspirato endotracheale / bronchiale / da tracheostomia Altri materiali Materiali bioptici Liquido pleurico Sangue (emocoltura, indagini sierologiche) Succo gastrico (per micobatteri) Tampone (aspirato) naso-faringeo (virus) Urine (ricerca antigeni Legionella , Pneumococco)

Aspirato tracheo-bronchiale Di semplice esecuzione, non richiede manovre invasive La coltura identifica di solito il patogeno in causa (alta sensibilità), ma insieme ad altri microrganismi non responsabili dell’infezione (bassa specificità) L’indagine microbiologica deve: determinare la carica batterica (coltura quantitativa) accompagnarsi all’esame microscopico (batteri e cellularità) Grossman R, Chest, 2000

Aspirato tracheo-bronchiale San Pedro, Chest, 2001

Lavaggio broncoalveolare Procedura invasiva Fattori che condizionano la “qualità” del BAL competenza dell’esecutore recupero > 10% della soluzione instillata immediato invio alla microbiologia terapia antibiotica in corso Idoneità del campione > 10 cellule per campo a x500 presenza di < 1% di cellule epiteliali Grossman R, Chest, 2000

Prelievi “protetti” e risultati microbiologici Colture PSB (>103 CFU/mL) Tecniche diagnostiche Esaminazione microscopica di fluidi da BAL (>5% organismi intracellulari) Colture BAL (>104 CFU/mL) 82% Sensibilità 89% Specificità 90% Valore predittivo Positivo Valore predittivo Negativo 91% 78% 83% 87% Mayhall G., Emerging Infectious Diseases, 2001 67% Sensibilità 95% Specificità 37-100% 89-100% 73% 82% Colture PSB(>103 CFU/mL) Tecniche diagnostiche Esaminazione microscopica di fluidi da BAL Colture BAL(>104 CFU/mL) Grossman R., Chest, 2000 Grosman R, Chest, 2000

Infezioni delle basse vie respiratorie Possibilmente campioni protetti Solo se CAP grave: Espettorato o BroncoAsp Emocoltura (IDSA 2007) Solo campioni protetti: Broncolavaggio Spazzolatura Emocoltura (FADOI,’07)

Diagnosi delle infezioni respiratorie - Più del 50% non sono diagnosticate - Non c’è un solo test per fare diagnosi - coltura secrezioni - emocoltura - ricerca antigeni (RSV, Legionella, S.pneumoniae, Aspergillus,…) - Per i batteri, spesso non è un problema tecnico, ma di interpretazione !!!!

Diagnosi: due quesiti - Se isolo patogeni (spesso presenti anche nel cavo orale), sono quelli colonizzanti o sono quelli che hanno raggiunto il polmone? In pratica: Ho raccolto quelli del cavo orale o quelli dell’infezione ?

Diagnosi: due quesiti - Se isolo non patogeni (normalmente non presenti nel cavo orale), sono quelli che hanno colonizzato il tratto respiratorio alto o hanno raggiunto anche il polmone? In pratica: Ho raccolto quelli delle alte vie o quelli dell’infezione ?

Infezioni delle basse vie respiratorie La contaminazione con la flora del cavo orale inficia il risultato dell’esame colturale Si possono associare altre indagini: - es. emocoltura in polmoniti da germi comunitari (es.S.pneumoniae) - indagini sierologiche (antigene urinario per STRPNE e Legionella) ma non è la maggior parte degli esami che analizziamo

Campioni NON protetti Passano attraverso il cavo orale: - Espettorato (anche indotto, protetto) Raccolti con broncoscopio attraverso il cavo orale: - Lavaggio tracheo-bronchiale Raccolti con aspirazione: - durante la broncoaspirazione di intubati: - Aspirato tracheo-bronchiale - attraverso fistola tracheostomica: - Aspirato da tracheo-stomia Il paziente tracheostomizzato non può espettorare e le secrezioni vengono raccolte per aspirazione. Ma questi malati si colonizzano rapidamente con BGN e altri germi come S.aureus che possono essere aspirati e dare polmonite. E qui è il solito problema: sono i colonizzanti o i responsabili dell’infezione?

Come evitare la raccolta dei colonizzanti? Diagnosi Come evitare la raccolta dei colonizzanti?

Campioni protetti - PSB= Brushing endo-bronchiale protetto - Mini-BAL= Lavaggio bronco-alveolare protetto - BAL= Lavaggio bronco-alveolare (più negli immuno-compromessi o polmoniti interstiziali)

VAP: Diagnosi CDC Draft 2002 -GISIG 1998 - i criteri tradizionali: - clinici (tosse, febbre, leucocitosi, secrezioni purulente) - strumentali (evidenze radiologiche di un infiltrato nuovo o progressivo) - microbiologici (coltura dell’aspirato endotracheale, l.pleurico, sangue) NON SONO SUFFICIENTI PER UNA VAP PERCHE’ ASPECIFICI E INAFFIDABILI

VAP: Standardizzazione dei metodi diagnostici VAP: Standardizzazione dei metodi diagnostici CDC Draft 2002 -GISIG 1998 - PSB (Protected Specimen Brush) - BAL (Broncho-Alveolar Lavage) - Mini-BAL (Protected Broncho-Alveolar Lavage)

Criteri di idoneità Esame microscopico Cellule bronchiali epiteliali squamose Neutrofili Batteri intracellulari Flora Cavo Orale Semina Non Protetti con 1 mcl Protetti con 10 mcl Rilevazione cariche Non Protetti > 106 ucf/ml Broncolavaggio > 104 ucf/ml Mini-BAL > 102 ucf/ml Identificazione microrganismi Patogeni Non Patogeni

Esame microscopico Idoneo Non idoneo Si esegue per verificare la qualità del materiale e per definire in via presuntiva i probabili patogeni. La qualità si stabilisce studiando il rapporto tra i GB e le SQ. Per quanto riguarda il presunto patogeno va ricordato anzituto che la soglia del microscopico è di 10.000 batteri/ml e poi che se ne possono osservare ma non crescono: questo perché le terapie antibiotiche possono comprometterne la vitalità e lo stesso per la sol.fisiologica. Il numero dei batteri osservati servirà anche per interpretare la coltura e valutare se identificare o meno. Idoneo Non idoneo

Lettura: media di 10 campi Esame microscopico: Q-score Lettura: media di 10 campi

Significative cariche >106 (10-100 UCF) Semina NON protetti Significative cariche >106 (10-100 UCF)

Significative cariche >103 (1-10 UCF) (104 per BAL: 10-100 colonie) Semina protetti Significative cariche >103 (1-10 UCF) (104 per BAL: 10-100 colonie)

…e valutare il germe in causa Cioccolato 1l (diluito 1:10) - assenza crescita - 1 CFU = 104 - 10 CFU = 105 - 100 CFU = 106 > 100 CFU = 107 Patogeni Non Patogeni FBM ATB +ID descrittivo FBM

Microrganismi respiratori Patogeni -BGN (fermentanti e non) -S. pneumoniae e beta-emolitici -S.aureus -Haemophilus influenzae -B.catarrhalis Non patogeni - S.coagulasi negativi - Strept. alfa-emolitici - Neisseriaceae - Altri Haemophilus

Emocoltura 20-30% polmoniti batteriche hanno batteriemia L’emocoltura dovrebbe essere sempre eseguita in caso di polmonite

Collaborare per vedere i problemi per quel che sono

Tenersi informati