STUDIO DI TRANSGENI E GENI ENDOGENI DI RIFERIMENTO PRESENTI IN ALIMENTI E MANGIMI A BASE DI SOIA E MAIS MEDIANTE DIGITAL PCR Corso di Laurea Magistrale in Biotecnologie Genomiche Industriali ed Ambientali RELATORE INTERNO Prof.ssa Giovanna Serino RELATORE ESTERNO Dott.ssa Marzia De Giacomo CANDIDATO Piero Onorati

Sviluppo delle colture GM dal 1996 al 2014 DIFFUSIONE DELLE COLTURE OGM A LIVELLO GLOBALE Sviluppo delle colture GM dal 1996 al 2014

NORMATIVA COMUNITARIA E NAZIONALE SULLA COMMERCIALIZZAZIONE DEGLI OGM NEL SETTORE ALIMENTARE Direttiva CE n. 18/2001 Regolamentazione sull’emissione nell’ambiente di OGM Regolamento CE n. 1829/2003 Autorizzazione di nuovi OGM e di alimenti e mangimi contenenti OGM Obbligo di etichettatura per alimenti e mangimi contenenti OGM (soglia 0,9%) Regolamento CE n. 1830/2003 Tracciabilità ed etichettatura di OGM e di alimenti e mangimi ottenuti da OGM Autorizzazione Utilizzo

METODI DI ANALISI PER GLI OGM 5’ 3’ forward primer R Q reverse Molecole target: DNA (template) o proteine Sistemi diagnostici: Per il DNA: primers e sonde Per le proteine: anticorpi Materiali di riferimento: Controlli positivi e negativi Calibranti per la quantificazione Analita

Metodi basati sulla sequenza nucleotidica METODI DI ANALISI PER GLI OGM Metodi basati sulla sequenza nucleotidica Monitoraggio in tempo reale dell’andamento della PCR Ct proporzionale alla quantità iniziale di DNA target Quantificazione relativa transgene endogeno % OGM = Uso di sonde di ibridizzazione (TaqMan) legate a molecole fluorescenti (reporter e quencher)

GENI ENDOGENI DI RIFERIMENTO TAXON SPECIFICI Necessità della selezione di un gene endogeno di riferimento adatto alla quantifica di OGM Superamento dei punti critici della real-time PCR nella quanitfica di OGM gestione elevato numero di CRM per rette di taratura e mancanza di CRM per eventi non autorizzati inibitori della PCR in matrici complesse analisi quantitative condizionate dall’efficienza di amplificazione Vantaggi nell’uso della digital PCR analisi quantitative assolute delle copie genomiche senza rette di calibrazione non influenzata da inibitori della PCR analisi quantitative svincolate dall’efficienza di amplificazione Specie specifio – Una o poche copie nel genoma – Rappresentativo di differenti varietà della stessa specie – Stabile nel genoma

SCOPO DEL LAVORO Selezione di geni endogeni di riferimento affidabili, in termini di specificità e stabilità nel genoma, delle specie zea mays e glycine max (ricerca in letteratura) Valutazione del loro utilizzo in tecniche di digital PCR Ottimizzazione e validazione del metodo di analisi in digital PCR Confronto dei metodi di analisi di digital e real-time PCR Valutazione dell’applicabilità del metodo in digital PCR a campioni di mangimi ed alimenti altamente processati

Gene endogeno selezionato per mais hmg GENI ENDOGENI DI RIFERIMENTO Gene endogeno selezionato per mais hmg presenza in singola copia nel genoma assenza di SNP nella sequenza sonda stabile nella replicazione di PCR sequenza conservata nel genoma Papazova et. al., 2010 Gene endogeno selezionato per soia Le1 presenza in singola copia nel genoma sequenza uniforme e stabile ampio utilizzo in metodi validati

METODI DI ANALISI PER GLI OGM digital PCR

OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Mais Soia Endogeno Transgene Variazione del protocollo termico di replicazione Temperatura °C 60 55 - 60 Numero di cicli termici 39 - 45 39 - 50 Variazione della concentrazione di primers e sonda Concentrazione Primers nM 900 - 300 Concentrazione Sonda nM 200 - 100 Variazione della concentrazione di DNA campione Concentrazione ng/µl 0,2 - 10

OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione del protocollo termico di replicazione n. Cicli Temperatura °C 39 60 45 hmg 41 55 MON810 50 Le1 GTS 40 3 2 Ogni prova è stata condotta in 5 replicati

Variazione del protocollo termico di replicazione OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione del protocollo termico di replicazione hmg mais 60° C 41 cicli 60° C 45 cicli FAM / VIC = fluorofori per sonde di PCR TaqMan

Variazione del protocollo termico di replicazione OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione del protocollo termico di replicazione Le1 soia 60° C 45 cicli 55° C 45 cicli FAM / VIC = fluorofori per sonde di PCR TaqMan

OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione della concentrazione di primers e sonda Concentrazione primers nM Concentrazione sonda nM Replicati sperimentali 900 200 6 600 500 160 400 130 300 100 Gene endogeno hmg di mais Primers 300 nM Sonda 100 nM

OTTIMIZZAZIONE DEL METODO IN digital PCR Variazione della concentrazione di DNA Materiale di riferimento certificato (CRM) di mais, gene endogeno hmg Concentrazione DNA ng/µl Lettura spettrofotometrica (copie genomiche/μl) Risultati medi digital PCR (copie genomiche/μl) Replicati sperimentali 0.2 73 24 ± 6 5 0.5 183 175 ± 10 1 367 333 ± 12 2 734 665 ± 25 1835 1266 ± 44 10 3670 3015 ± 51 Materiale di riferimento certificato (CRM) di mais, transgene MON810 Concentrazione DNA ng/µl Lettura spettrofotometrica (copie genomiche/μl) Risultati medi digital PCR (copie genomiche/μl) Replicati sperimentali 0.2 2 5 0.5 7 ± 4 1 11 12 ± 4 22 24 ± 5 55 40 ± 12 10 109 89 ± 18

Concentrazione DNA (ng/μl) Numero replicati sperimentali VALIDAZIONE DEL METODO IN digital PCR Range dinamico Limite di quantificazione (LOQ)* Limite di rilevabilità (LOD)* Precisione Accuratezza Specificità* Applicabilità Praticabilità* Punto di diluizione Concentrazione DNA (ng/μl) Diluizioni Numero replicati sperimentali C1 1,3 1 : 1 7 C2 0,65 1 : 2 C3 0,1625 1 : 4 C4 0,065 1 : 2,5 C5 0,0325 C6 0,0065 1 : 5 CRM Mais MON810 5% m/m 2.98% cg/cg

VALIDAZIONE DEL METODO IN digital PCR Range dinamico y = 0,923x - 62,526 R² = 0,998 y = 0,824x + 3,279 R² = 0,999

Applicabilità su matrici complesse VALIDAZIONE DEL METODO IN digital PCR Applicabilità su matrici complesse Circuiti interlaboratorio per il controllo di qualità esterno dei metodi Soglia di accettazione ±25% del valore certificato

VALIDAZIONE DEL METODO IN digital PCR hmg Concentrazione DNA (ng/μl) Fattore di diluizione Numero medio di copie genomiche Rapporto diluizioni misurato Deviazione standard relativa % Numero medio pozzetti accettati Numero medio pozzetti positivi 1,3 1 6654 3,2 18445 18581 0,65 2 3016 2,2 7,4 19018 19328 0,1625 4 747 4,0 18754 19079 0,065 2,5 297 18281 18478 0,0325 146 2,0 6,3 18578 18945 0,0065 5 26 5,6 21,0 18566 19084 MON810 178 10,7 17905 18043 88 14,9 17767 18041 3,4 12,5 17985 18245 13 1,9 44,8 17256 17962 8 1,7 57,2 17613 17806 4,1 103,3 18167 18570

VALIDAZIONE DEL METODO IN digital PCR Accuratezza C1 C2 C4 C5 C6 Soglia di accettazione ±25% del valore certificato

CONFRONTO TRA dPCR E real-time PCR Parametro dPCR qPCR Range dinamico 7156 - 1 copie LOQ MON810 26 cg MON810 24 cg LOD MON810 6 cg MON810 19 cg Precisione (RSDr%) hmg < 25% MON810 < 25% hmg < 35% MON810 < 35% Accuratezza (Bias) Da -18% a 10% Da -6% a 2% Applicabilità - matrice % MON810 in accordo con i valori assegnati nei PT NA Praticabilità - tempo necessario all'ottenimento dei risultati per analisi 6 ore 5 ore - prezzo per campione 31,34 € 35 €

CONCLUSIONI I geni endogeni selezionati ed utilizzati in questo studio sono stati l’hmg codificante la proteina high mobility group per il mais ed il gene Le1 codificante la lectina per la soia. Questi sono stati utilizzati per condurre l’ottimizzazione e la validazione del metodo in digital PCR. Elevate precisione ed accuratezza Elevata sensibilità Possibilità di applicazione su matrici complesse altamente processate Costi e tempistiche di lavoro contenuti Possibilità di trasferire facilmente metodi analitici già validati Ottenere risultati di analisi per il controllo di OGM in numero assoluto di copie genomiche senza l’utilizzo di curve di calibrazione Il confronto tra le due tecniche di quantificazione ha mostrato come la digital PCR sia in grado di eguagliare ed in diversi casi di migliorare le prestazioni ottenibili in real-time PCR. I dati di questo studio sono stati ottenuti nell’ambito di un progetto di ricerca sull’applicazione della digital PCR nel controllo ufficiale degli OGM coordinato dall’IZS delle regioni Lazio e Toscana e presentati all’interno di un gruppo di lavoro coordinato dall’ENGL (European Network of GMO Laboratories)

PROSPETTIVE FUTURE Possibilità di effettuare analisi in duplex e multiplex così da abbattere i costi grazie ai sistemi di droplet digital PCR. Applicazione a metodi di screening quantitativi. Validazione del metodo per i campioni di soia in dPCR. Sviluppo del metodo multiplex multi-screening per 6 eventi specifici di soia in unica analisi (nell’ambito del progetto coordinato dall’IZSLT).

GRAZIE DELL’ATTENZIONE (Kary Mullis) Un grande grazie alla professoressa Giovanna Serino a Roberta Onori, Marzia De Giacomo, Carlo Brera e alle “grandi” a tutte le ragazze (ed i ragazzi, pochi, tre) del laboratorio OGM e Micotossine dell’ISS

Droplet digital PCR multipex

Stato delle autorizzazioni degli alimenti e dei mangimi GM in UE: eventi autorizzati 38 eventi singoli 33 eventi stacked Eventi stacked: nuovi prodotti con più di un evento di trasformazione

Stato delle autorizzazioni degli alimenti e dei mangimi GM in UE: eventi autorizzati 12 eventi soia (di cui 1 stacked) (+ 7 in corso di autorizzazione) 39 eventi mais (di cui 26 stacked) (+ 9 in corso di autorizzazione) 7 eventi colza (di cui 3 stacked) (+ 2 in corso di autorizzazione) 10 eventi cotone (di cui 3 stacked) (+ 1 in corso di autorizzazione) 1 evento barbabietola da zucchero 2 microorganismi GM